1、.川貝母檢驗標準操作規(guī)程文件編碼： s0p-qc-zj-3017-03制定部門：質(zhì)量檢驗中心題目頒發(fā)部門：質(zhì)量管理部川貝母檢驗標準操作規(guī)程分發(fā)部門：質(zhì)量管理部、質(zhì)量制定人：日期 :年月日檢驗中心審核人：日期 :年月日批準人：日期：年月日生效日期 :2012年 10 月 1日變更歷史： 1.2003 年 3月制定； 2.2005 年7月執(zhí)行中國藥典 2005年版第一次修訂； 3.2010 年 10月執(zhí)行中國藥典 2010年版第二次修訂。 4.2012 年10月 1 日執(zhí)行中國藥典 2010年版第一增補本第三次修訂。目的：建立川貝母檢驗標準操作規(guī)程。規(guī)范檢驗操作，確保川貝母質(zhì)量。適用范圍：適用于川

2、貝母的檢驗。責 任 者：質(zhì)量管理部經(jīng)理、質(zhì)檢中心主任、質(zhì)量檢驗員。內(nèi)容：1 品名：川貝母2 取樣：按藥材和飲片取樣標準操作規(guī)程（ sop-qc-zj-6065）取樣3 檢驗依據(jù)：川貝母內(nèi)控質(zhì)量標準（ stp-qs-zj-3015）4 性狀松貝 取本品，置明亮處用肉眼觀察，呈類圓錐形或近球型 ,尺量，高 0.30.8cm，直徑 0.30.9cm。，表面類白色。外層鱗葉 2 瓣，大小懸殊，大瓣緊抱小瓣，未抱部分呈新月形，習稱“懷中抱月”；頂部閉合，內(nèi)有類圓形，頂端稍尖的心芽和小鱗葉 12 枚；先端鈍圓或稍尖，微凹入，中心有 1 灰褐色的鱗莖盤，偶有殘存須根。質(zhì)硬而脆，斷面白色，富粉性。氣微，味微苦

3、。青貝 呈類扁球形，高 0.41.4cm，直徑 0.41.6cm。外層鱗葉 2 瓣，大小相近，相對抱合，頂部開裂，內(nèi)有心芽和小鱗葉 23 枚及細圓柱形的殘莖。爐貝 呈長圓形，高 0.72.5cm，直徑 0.52.5cm。表面類白色或淺棕黃色，有的具棕色斑點。外層鱗葉 2 瓣，大小相近，頂部開裂而略尖，基部稍尖或較鈍。;.5 鑒別：5.1儀器：顯微鏡、超聲波清洗機、電子恒溫水浴鍋、薄層噴霧氣壓泵、電子天平5.2試劑與試液5.2.1試劑：二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、濃氨試液5.2.2 試液水合氯醛試液：取水合氯醛50g，加水 15ml 與甘油 10ml 使溶解，即得。甘油乙醇試液：取甘油、稀乙醇各1

4、 份，混合，即得。碘化鉀溶液：取碘化鉀16.5g ，加水使溶解成100ml，即得。臨用新制。稀碘化鉍鉀試液：取次硝酸鉍0.85g ，加冰醋酸 10ml 與水 40ml 溶解后，即得。臨用前取5ml ，加碘化鉀溶液（4 10） 5ml ，再加冰醋酸20ml，加水稀釋至100ml，即得。亞硝酸鈉乙醇試液：取亞硝酸鈉1g，加乙醇使溶解成100ml，即得。5.3 對照品與：貝母辛對照品、貝母素乙對照品5.4 操作方法5.4.1按顯微鑒別法標準操作規(guī)程（sop-qc-zj-6034）檢查。松貝、青貝、取本品粉末 10g，過四號篩，平鋪于潔凈的白紙上，在明亮處用肉眼觀察，本品粉末類白色。挑取少許置載玻片上

5、，滴加水合氯醛試液2 滴，將載玻片置酒精燈火焰上方 2cm處往返擺動加熱至邊緣起小泡，即停止加熱，補充試液后再加熱，直至透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2 滴，蓋上蓋玻片。置顯微鏡下觀察，淀粉粒甚多，廣卵形、長圓形或不規(guī)則圓形，有的邊緣不平整或略作分枝狀，直徑564m，臍點短縫狀、點狀、人字狀或馬蹄狀，層紋隱約可見。表皮細胞類長方形，垂周壁微波狀彎曲，偶見不定式氣孔，圓形或扁圓形。螺紋導管直徑526m。爐貝取本品粉末 10g，過四號篩，平鋪于潔凈的白紙上，在明亮處用肉眼觀察，本品粉末類白色。挑取少許置載玻片上，滴加水合氯醛試液2 滴，將載玻片置酒精燈火焰上方 2cm處往返擺動加熱至邊緣起小泡，

6、即停止加熱，補充試液后再加熱，直至;.透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2 滴，蓋上蓋玻片。置顯微鏡下觀察，淀粉粒廣卵形、貝殼形、腎形或橢圓形，直徑約至60m，臍點人字狀，星狀或點狀，層紋明顯。5.4.2取本品粉末 10g，置具塞小錐形瓶中 加濃氨試液 10ml，密塞，浸泡 1 小時，加二氯甲烷40ml，超聲處理 1 小時，濾過，濾液蒸 干，殘渣加甲醇 o.5mi 使溶解，作為供試品溶液。另取貝母素乙對照品，加甲醇制成每1ml 含 1mg的溶液 . 作為對照品溶液。按薄層色譜法（附錄vi b ）試驗，吸取供斌品溶液16l 、對照品溶液2l ，分別點于同一硅膠g薄層板上，以乙酸乙酯 - 甲醇 -

7、濃氨試液 - 水(18 ：2：1：0.1) 為展開劑，展開，取出，晾干，依次噴以稀碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。5.4.3聚合酶鏈式反應(yīng) - 限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法。模板 dna提取取本品 0.1 g ，依次用 75 %乙醇 1ml、滅菌超純水1ml 清洗，吸干表面水分，置乳缽中研磨成極細粉。取20mg，置 1.5ml 離心管中，用新型廣譜植物基因組dna快速提取試劑盒提取 dna：加入緩沖液 ap1 400l和 rna 酶溶液（ 10 mg/ml ）4l，渦旋振蕩， 65 水浴加熱10 分鐘，加入緩沖液ap2 130l，充分混

8、勻，冰浴冷卻5 分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘14000 轉(zhuǎn)） 10 分鐘；吸取上清液轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加入1.5 倍體積的緩沖液 ap3/e，混勻，加到吸附柱上，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000 轉(zhuǎn)） 1 分鐘，棄去過濾液，加入漂洗液 700 l，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000 轉(zhuǎn)） 30 秒，棄去過濾液；再加入漂洗液500l，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 12000轉(zhuǎn)） 30秒，棄去過濾液；再離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000 轉(zhuǎn)） 2 分鐘，取出吸附柱，放入另一離心管中，加入50l洗脫緩沖液，室溫放置3 5 分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000 轉(zhuǎn)） 1 分鐘，將洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2 分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為

9、每分鐘12000 轉(zhuǎn)） 1 分鐘，取洗脫液，作為供試品溶液，置 4冰箱中備用。另取川貝母對照藥材0.1 g ，同法制成對照藥材模板dna溶液。pcr-rflp反應(yīng);.鑒別引物： 5cgtaacaaggtttccgtaggtgaa3和5gctacgttcttcatcgat3。pcr 反應(yīng)體系：在200 l 離心管中進行，反應(yīng)總體積為30 l，反應(yīng)體系包括 10 pcr 緩沖液 3 l，二氯化鎂（25 mmol/l ）2.4 l，dntp（10 mmol/l ）0.6 l，鑒別引物（30 mol/l ）各0.5 l，高保真 taq dan 聚合酶（ 5 u/ l）0.2 l，模板1l，無菌超純水2

10、1.8 l。將離心管置 pcr 儀， pcr反應(yīng)參數(shù)： 95預變性4 分鐘，循環(huán)反應(yīng)30 次（95 30 秒， 5558 30秒， 72 30 秒）， 72 延伸 5 分鐘。取 pcr反應(yīng)液，置500 l離心管中，進行酶切反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20 l，反應(yīng)體系包括 10 酶切緩沖液 2 l，pcr反應(yīng)液 6 l，sma i （10 u/ l）0.5 l，無菌超純水11.5 l，酶切反應(yīng)在 30 水浴反應(yīng) 2 小時。另取無菌超純水，同法上述 pcr-rflp反應(yīng)操作，作為空白對照。電泳檢測照瓊脂糖凝膠電泳法，膠濃度為1.5 % ，膠中加入核酸凝膠染色劑gelrad，供試品與對照藥材酶切反應(yīng)液的上樣

11、量分別為8ldna，dna分子標記上樣量為1 l（0.5 g/ l）。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100250 bp 應(yīng)有兩條 dna條帶，空白對照無條帶。6 檢查6.1 水分：按水分測定法標準操作規(guī)程（sop-qc-zj-6020）烘干法測定，不得過15.0%。6.1.1 儀器：鼓風電熱恒溫干燥箱、電子天平。6.1.2 操作方法：接通電子天平電源，啟動電子天平，使電子天平預熱30 分鐘。取潔凈的稱量瓶，置烘箱內(nèi)100 105干燥 2 小時，取出，置干燥器中室溫放置30 分鐘，精密稱定重量，再置烘箱內(nèi)100

12、105干燥 1 小時，取出置干燥器中室溫放置30分鐘，精密稱定重量，直至連續(xù)兩次干燥后稱重的差異在0.3mg 以下為止。取供試品最;.粗粉 25g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5mm。精密稱定，記錄數(shù)據(jù)，打開瓶蓋在100105干燥 5 小時，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30 分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1 小時 ，冷卻，稱重，并記錄數(shù)據(jù)，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過 5mg為止。根據(jù)減失的重量，計算出供試品中含水量(%)。（干燥前樣品稱量瓶）（干燥后樣品稱量瓶）水分 %-100%（干燥前樣品稱量瓶）- 稱量瓶6.2 總灰分：按灰分測定法標準操作規(guī)程（ sop-qc-zj-60

13、16)總灰分測定法測定，不得過 5.0%。6.2.1儀器：節(jié)能電阻爐、電子天平、坩鍋。6.2.2操作方法：接通電子天平電源，啟動電子天平，使電子天平預熱30 分鐘。取潔凈的坩堝，置節(jié)能電阻爐內(nèi)，將坩堝蓋斜蓋于坩堝上，經(jīng)加熱至600熾灼約 1 小時，停止加熱，待節(jié)能電阻爐溫度冷卻至約300，取出坩堝，置干燥器內(nèi)，蓋好坩堝蓋，放冷至室溫，精密稱定重量，再以同樣條件重復操作，直至連續(xù)兩次干燥后稱重的差異在 0.3mg 以下為止。取能通過二號篩并混合均勻的粉末23g，置熾灼至恒重的坩堝中，在電子天平上精密稱定，放入節(jié)能電阻爐內(nèi)，緩緩熾熱，至完全炭化呈黑色，逐漸升高溫度至500 600，停止加熱，待節(jié)能

14、電阻爐溫度冷卻至約300，取出觀察 ，直至完全灰化，取出坩堝，置干燥器內(nèi)，蓋好坩堝蓋，放冷至室溫，精密稱定重量，再以同樣條件重復操作，直至連續(xù)兩次熾灼后稱重的差異在0.3mg 以下為止。并記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)殘渣重量，計算供試品中總灰分的含量。（灰分坩堝）- 空坩堝總灰分 %100%（樣品坩堝）- 空坩堝6.3浸出物：按浸出物測定法標準操作規(guī)程（sop-qc-zj-6015）項下的熱浸法測定，用稀乙醇作溶劑，不得少于9.0%。6.3.1儀器：鼓風電熱恒溫干燥箱、電子天平、電子恒溫水浴鍋。6.3.2試劑：稀乙醇：取乙醇53ml，加水制成 100ml 即得。;.6.3.3 操作方法：接通電子天平電源，啟

15、動電子天平，使電子天平預熱30 分鐘。取潔凈的蒸發(fā)皿，置烘箱內(nèi) 100 105干燥 1 小時，取出，置干燥器中室溫放置 30分鐘，精密稱定重量，再置烘箱內(nèi) 100105干燥 1 小時，取出置干燥器中室溫放置30分鐘，精密稱定重量，直至連續(xù)兩次干燥后稱重的差異在0.3mg 以下為止。 取能通過二號篩并混合均勻的供試品約 4g，置 250ml 的錐形瓶中，精密加稀乙醇100ml，密塞，稱定重量，靜置 1 小時后連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 小時。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸

16、干后，于100 105干燥 3 小時 ，置干燥器中冷卻30 分鐘，迅速精密稱定重量。并記錄數(shù)據(jù)。除另有規(guī)定外，以干燥品計算供試品浸出物的含量。（浸出物 蒸發(fā)皿)蒸發(fā)皿 100浸出物 %100%供試品重量 （1水分 %） 256.4 二氧化硫殘留量：按二氧化硫殘留量測定法標準操作規(guī)程（sop-qc-zj-6062）測定，不得過 150mg/kg。6.4.1 儀器： so2 測定裝置（ 1000ml）、電熱套、 10ml 棕色滴定管、 250ml 錐形瓶、磁力攪拌器、 100ml 量筒。6.4.2試液6mol/l 鹽酸溶液：取鹽酸54ml，置100ml 量瓶中，加水至刻度，搖勻。淀粉指示液：本液應(yīng)

17、臨用新制。取可溶性淀粉 0.5g ，加水 5ml 攪勻后，緩慢傾入100ml 沸水中，隨加隨攪拌繼續(xù)煮沸2 分鐘，放冷，傾取上層清液，即得。0.01mol/l 碘滴定液：6.4.3儀器裝置：a 為 1000ml 兩頸圓底燒瓶； b 為豎式回流冷凝管； c 為（帶刻度 ) 分液漏斗；d 為連接氮氣流入口； e 為二氧化硫氣體導出口；;.6.4.4操作方法：取藥材細粉約 10g，精密稱定 w，置兩頸圓底燒瓶中，加水 300 400ml（應(yīng)加水至沒過氮氣導氣管的下端），取6mol/l 鹽酸溶液 10ml 加入帶刻度分液漏斗中。錐形瓶里加入水 125ml 和淀粉指示液 1ml 作為吸收液，置于磁力攪拌

18、器上不斷攪拌。打開冷凝管，將冷凝管的上端口處連接一橡膠導氣管置于錐形瓶內(nèi)液面以下。連接導氣管入口。開通氮氣，調(diào)節(jié)適宜的氣體流量（氮氣流速約為0.2l/min, 至蒸餾瓶內(nèi)有氣泡均勻排出）。打開帶刻度分液漏斗的活塞，使鹽酸溶液10ml 流入燒瓶中。給兩頸燒瓶內(nèi)的溶液加熱至沸，并保持微沸約3 分鐘后開始用碘滴定液（0.01mol/l ）滴定，吸收液置于磁力攪拌器上不斷攪拌，至吸收液顯藍色或藍紫色持續(xù)30 秒鐘不完全消褪，記錄樣品消耗滴定液體積a；并用空白試驗校正，記錄消耗滴定液體積b。每 1ml 的碘滴定液（ 0.01mol/l ）相當于 0.6406mg 的 so2。c為碘滴定液濃度的校正因子供

19、試品中二氧化硫殘留 量 mg/kg( a b) c 100 0.64061000w7 含量測定 ：按紫外 - 可見分光光度法標準操作規(guī)程（ sop-qc-zj-6035）測定。7.1 儀器：分光光度計、電子天平、電子恒溫水浴鍋。7.2 試劑：三氯甲烷、甲醇試液0.05溴甲酚綠緩沖液：取溴甲酚綠0.05g，置 100ml 容量瓶中，加入0.2mol/l 氫氧化鈉溶液 6ml，振搖使溶解，加磷酸二氫鉀1g，加水使溶解并稀釋至刻度，即得7.3 對照品：西貝母堿對照品7.4操作方法對照品溶液的制備精密稱取 西貝母堿對照品5mg，置 25ml 棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制成濃度為c 對（每 1ml 含 0.2mg）的溶液，即得。標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4m1、0.6ml、1.0ml，置25ml 具塞刻度試管中，分別補加三氯甲烷至10.0ml，再用大肚吸管精密加水5ml、再精密加 0.05溴甲酚綠緩沖液2m1，密塞，劇烈振搖，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 分鐘。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以三氯甲烷試劑為空白試劑，按紫外;.- 可見分光光度法標準操作規(guī)程（ sop-qc-zj-6035），在 415nm 的波長處測定吸光度，以