1、實(shí)驗四 電鏡切片制作與觀察實(shí)驗?zāi)康膙了解掃描電鏡生物樣品的常規(guī)制備技術(shù)，重點(diǎn)掌握樣品的表面處理方法，臨界點(diǎn)干燥儀和離子濺射儀的結(jié)構(gòu)與工作原理。v了解生物樣品超薄切片的一般制備技術(shù)，重點(diǎn)掌握包埋與聚合、玻璃刀的制作、修塊、銅網(wǎng)及其支持膜、切片厚度判斷等。v了解H-7000透射電鏡的結(jié)構(gòu)及其工作原理，重點(diǎn)是鏡筒系統(tǒng)。實(shí)驗原理1、電子束的特點(diǎn)穿透能力有限，不超過100nm。2、電子成像機(jī)制電子成像的反差主要源于樣品散射電子能力的差異。3、生物樣品的特點(diǎn)含水量高、質(zhì)地柔軟、對熱和電子束敏感，散射電子的能力弱且差異小。4、掃描電鏡及常規(guī)掃描電鏡生物樣品制備技術(shù)（1）掃描電鏡掃描電鏡是一種利用電子束掃描樣

2、品表面從而獲得樣品信息的電子顯微鏡。掃描電鏡由三大部分組成：真空系統(tǒng)，電子束系統(tǒng)以及成像系統(tǒng)。（2）掃描電鏡樣品制備要求掃描電鏡以觀察樣品的表面形態(tài)為主。掃描電鏡樣品的制備，必須滿足以下要求：保持完好的組織和細(xì)胞形態(tài)；充分暴露欲觀察的部位；良好的導(dǎo)電性和較高的二次電子產(chǎn)額；保持充分干燥的狀態(tài)。（3）掃描電鏡樣品制備流程某些含水量低且不易變形的生物材料，可以不經(jīng)固定和干燥而在較低加速電壓下直接觀察，如動物毛發(fā)、昆蟲、植物種子、花粉等。對大多數(shù)的生物材料，則應(yīng)首先采用化學(xué)或物理方法固定、脫水和干燥，然后噴鍍碳與金屬以提高材料的導(dǎo)電性和二次電子產(chǎn)額。具體步驟包括：取材、清洗、固定、脫水、干燥（置換）

3、、粘托、導(dǎo)電處理等。5、透射電鏡及超薄切片制備技術(shù)（1）透射電鏡透射電鏡是利用透射電子成像的電子顯微鏡。透射式電子顯微鏡的總體結(jié)構(gòu)包括鏡體和輔助系統(tǒng)兩大部分，鏡體部分包含：照明系統(tǒng)（電子槍和聚光鏡）、成像放大系統(tǒng)（樣品室、物鏡、中間鏡和投影鏡）、觀察記錄系統(tǒng)（觀察室、照相室）。輔助系統(tǒng)包含：真空系統(tǒng)（機(jī)械泵、擴(kuò)散泵和真空閥）、電路系統(tǒng)（電源變換和調(diào)整控制）、水冷系統(tǒng)。（2）透射電鏡樣品制備要求樣品徹底干燥、要提高樣品反差、樣品要薄。（3）超薄切片制備技術(shù)由于一般透射電鏡的電子束穿透能力較弱，必須把標(biāo)本切成厚度小于100nm的薄片，這種薄片稱為超薄切片，超薄切片的厚度通常為50-70nm。超薄切

4、片的制作流程與石蠟切片類似，包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、修塊、切片、染色等步驟。實(shí)驗步驟1、常規(guī)掃描電鏡樣品制備技術(shù)（1）基本方法（2）樣品觀察面的處理方法 一般表面處理方法 樣品斷裂面處理方法（3）干燥的干燥方法 自然干燥法 真空干燥法 冷凍真空干燥法 臨界點(diǎn)干燥法（臨界點(diǎn)干燥儀）（4）樣品的導(dǎo)電處理 真空鍍膜法 離子濺射鍍膜法（離子濺射儀） 組織導(dǎo)電技術(shù)2、超薄切片制備技術(shù)（1）、基本方法取材漂洗（生理鹽水前固定（ 2.5% 戊二醛， 4oC 冰箱 2 小時以上）漂洗（ 0.1M 磷酸緩沖液/ 3 次/ 45 分鐘）后固定 (1% 鋨酸 1 小時左右 ) 漂洗（ 0.1M 磷酸

5、緩沖液/3 次/45 分鐘）梯度脫水浸透、包埋聚合超薄切片飽和醋酸鈾染色30分鐘，檸檬酸鉛染色5-8分鐘。透射電鏡樣品制作操作流程圖（2）半薄切片 玻璃刀 半薄切片機(jī) 修塊（3）超薄切片 工具：超薄切片機(jī)、鉆石刀、水槽 超薄切片流程：切片撈片撥片載網(wǎng) 切片厚度（切片干涉色）樣品 載網(wǎng) 支持膜（4）電子染色 醋酸雙氧鈾染色及鈾污染 檸檬酸鉛染色及鉛污染3、H-7000型透射電子顯微鏡的主要結(jié)構(gòu)（1）鏡筒結(jié)構(gòu)電子控制系統(tǒng)（2）電子光學(xué)系統(tǒng)在這個系統(tǒng)中，主要包括共用電源、高壓電源、透鏡電源、束偏轉(zhuǎn)電源、控制電路、相機(jī)電源以及CRT顯示電路。（3）真空系統(tǒng)和冷卻系統(tǒng)真空系統(tǒng)H-7000透射電鏡的真空系

6、統(tǒng)是有兩套真空線路構(gòu)成的，因此，它擁有兩套抽真空設(shè)備，即兩三臺油旋轉(zhuǎn)泵和兩臺油擴(kuò)散泵；其他組成部分包括：真空管道、預(yù)抽管道、預(yù)抽室(膠片干儲裝置)、潘寧規(guī)(PE)、普拉寧規(guī)(PL)、抽真空指令裝置和保險裝置。冷卻系統(tǒng)包括：冷卻水循環(huán)裝置和整機(jī)冷卻管道。4、上機(jī)操作觀察到的視野實(shí)驗結(jié)論思考題：1、對比石蠟切片制作，描述常規(guī)掃描電鏡生物樣品制備流程、透射電鏡超薄切片制作流程。掃描電鏡生物樣品主要分兩大類，一類為含水量少的硬組織，如毛發(fā)、牙齒及植物的花粉、孢子、種子等。此類樣品一般含硅質(zhì)、鈣質(zhì)，角質(zhì)，砝瑯質(zhì)和纖維素等成份，所以通常只經(jīng)過表面清潔、裝臺(粘膠)、導(dǎo)電處理等簡單過程即可進(jìn)行觀察。如要觀察

7、其斷面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)時，經(jīng)斷裂、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺、鍍膜處理，即可進(jìn)行觀察拍照。另-類為含水分較多的軟組織，如大多數(shù)的動植物器官、組織及細(xì)菌等均屬此類。對于此類樣品，在金屬鍍膜前，一般都需經(jīng)過固定、脫水、干燥等處理，如不經(jīng)處理或處理不當(dāng)，就會造成樣品損傷和變形，出現(xiàn)各種假像，因此對每一處理步驟都應(yīng)給予重視。超薄切片技術(shù)由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術(shù)是最基本、最常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似，需要經(jīng)過取材、固定、脫水、

8、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。2、生物樣品超薄切片制備過程中的難點(diǎn)操作有哪些？(1)取材:快;組織塊要小,使電子束可以穿透;低溫操作,減緩自溶性改變;避免損傷.(2)固定固定是生物電鏡術(shù)中最重要的一步,又有許多因素需要注意,如固定液的pH/濃度/滲透壓/固定方式/溫度/組織塊大小等.固定的好壞又影響細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的保存,只有良好的固定才能獲得真實(shí)的形態(tài)學(xué)圖像.(3)脫水少量多次使樣品完全干燥。(4)滲透與包埋包埋劑要有適當(dāng)粘度，能迅速而均勻地滲入標(biāo)本，便于操作；能與脫水劑完全混溶；聚合要充分、均勻且聚合前后體積變化極小，以保證細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)不受損害；有良好的切割性能，便于操作；耐受高速電子束轟

9、擊，性能穩(wěn)定；電鏡下不顯示細(xì)微結(jié)構(gòu)，保證電鏡圖像的真實(shí)性。(5)支持膜的制作耐高溫、無磁性；平整；網(wǎng)孔要多，孔間距要?。涣畠r。(6)超薄切片機(jī)的正確使用。3、敘述透射電鏡H-7000的工作原理。比較部分光學(xué)顯微鏡透射電鏡光源可見光(日光、電燈光)電子源(電子槍)照明控制玻璃聚光鏡電子聚光鏡樣本1mm厚的載玻片約10nm厚的薄膜放大成象系統(tǒng)玻璃透鏡電子透鏡介質(zhì)空氣和玻璃高度真空像的觀察直接用眼利用熒光屏聚焦方法移動透鏡改變線圈電流或電壓分辨本領(lǐng)200nm0.20.3nm有效放大倍數(shù)103106物鏡孔徑角約70010景深較小較大焦長較短教長像的記錄照相底板照相底板通過電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡比較，便

10、于理解其工作原理。4、利用臨界點(diǎn)干燥儀干燥樣品時，樣品盒放置濾紙的目的是什么？濾紙的干濕狀態(tài)可顯示溶解置換是否充分完成。如置換不充分，重復(fù)一個浸泡和凈化步驟。5、離子濺射儀如何控制樣品鍍膜的厚度？濺射是入射粒子和靶的碰撞過程。入射粒子在靶中經(jīng)歷復(fù)雜的散射過程，和靶原子碰撞，把部分動量傳給靶原子，此靶原子又和其他靶原子碰撞，形成級聯(lián)過程。在這種級聯(lián)過程中某些表面附近的靶原子獲得向外運(yùn)動的足夠動量，離開靶被濺射出來。濺射的特點(diǎn)是：(1)濺射粒子(主要是原子，還有少量離子等)的平均能量達(dá)幾個電子伏，比蒸發(fā)粒子的平均動能kT高得多(3000K蒸發(fā)時平均動能僅0.26eV)，濺射粒子的角分布與入射離子的

11、方向有關(guān)。(2)入射離子能量增大(在幾千電子伏范圍內(nèi))，濺射率(濺射出來的粒子數(shù)與入射離子數(shù)之比)增大。入射離子能量再增大，濺射率達(dá)到極值；能量增大到幾萬電子伏，離子注入效應(yīng)增強(qiáng)，濺射率下降。(3)入射離子質(zhì)量增大，濺射率增大。(4)入射離子方向與靶面法線方向的夾角增大，濺射率增大(傾斜入射比垂直入射時濺射率大)。(5)單晶靶由于焦距碰撞(級聯(lián)過程中傳遞的動量愈來愈接近原子列方向)，在密排方向上發(fā)生優(yōu)先濺射。(6)不同靶材的濺射率很不相同。6、描述通過透射電鏡熒光屏看到的的海參上皮細(xì)胞。細(xì)胞膜細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)（海參上皮細(xì)胞6000）海參上皮細(xì)胞細(xì)胞形狀不規(guī)則，略呈圓形。細(xì)胞核大較為松散；細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器含量較多，如線粒體和淀粉粒。內(nèi)有脂類空泡，細(xì)胞連接不明顯。注意事項：1.機(jī)槍必須檢查各輔助設(shè)備是否正常，包括檢查空氣壓縮機(jī)、循環(huán)冷卻器、穩(wěn)壓電源、共有電源。特別應(yīng)注意檢查