1、DNA凝膠電泳DNA agarose gel electrophoresis,實驗七,瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)

2、、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNAIDNAocDNA 當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。,實驗原理,實驗材料：PCR產(chǎn)物,植物基因組DNA,質(zhì)粒DNA等，購買 或自行提取純化。 實驗試劑： 5TBE電泳緩沖液： 6電泳載樣緩沖液：0.25 溴粉藍(lán)，40(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4。 溴化乙錠(EB)溶液母液：將EB配制成10 m

3、g/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。,實驗材料和試劑,微波爐,實驗儀器,凝膠電泳槽,凝膠成像系統(tǒng),實驗步驟,取5TBE緩沖液20mL加水至200mL，配制成0.5TBE稀釋緩沖液，待用。 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL 0.5TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中

4、加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。,加樣：取10L DNA樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?/p>

5、60-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。 觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。,瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定： 1、 DNA的分子大小 2、 瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構(gòu)象 4、 電源電壓 5、嵌入染料的存在 6、 離子強(qiáng)度影響,DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶,EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要專門處理后才可丟棄。 當(dāng)EB太多, 膠染色過深，DNA帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，30mi