1、正文果膠酶的固定化及其活力測定一、目的：果膠酶（EC.3.2.1.15）廣泛存在于植物界，參與果實的成熟及其它代謝過程。在果品加工業(yè)中，果膠酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。果膠酶的固定化將有助于提高酶的利用率，同時還可減少外源物質(zhì)對果制品的污染。果膠酶需求量大，且多為一次性使用，既造成了很大的浪費，又大大提高了產(chǎn)品生產(chǎn)成本。固定化果膠酶可以重復(fù)多次使用，能夠減少果膠酶的使用量，節(jié)約生產(chǎn)成本。通過本實驗，了解載體的制備方法，掌握酶的固定化原理及方法。二、原理：本實驗固定化方法為共價結(jié)合法。以殼聚糖為載體，通過戊二醛共價交聯(lián)固定化果膠酶。殼聚糖是從蟹、蝦外殼中提取的一種氨基多糖（-氨基-1.4-

2、葡萄糖多聚物），對人和動物無毒副作用，是一種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，機械性能好，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱性好的酶固定化載體材料，特別是殼聚糖分子中含有游離的氨基，通過化學(xué)交聯(lián)劑（如戊二醛）很容易與酶發(fā)生間接共價結(jié)合，使酶牢固地固定在殼聚糖分子上。果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水楊酸與醛糖共熱能產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和含有呈色氨基化合物的反應(yīng)液顏色深淺成正比，在540nm下測其吸光度，從而可計算出果膠酶活力。三、試劑及儀器儀器：冷凍離心機 分光光光度計 比色皿（8只） 搖床 水浴箱 混合振蕩器 天平 瓷盤 藥匙 剪刀(1把) 記號筆（1支） 通風(fēng)櫥 吸水紙

3、具塞刻度試管（4支） 三角瓶（2支） 燒杯（100ml3個） 試管架（1個）試管（6支） 量筒（100ml1個） 滴管（16個） 離心管(5ml2個,50ml1個)移液管架(1個) 移液管(2ml3個,5ml1個) 注射器（1支） 滴管(1個)吸耳球（1個） 洗瓶（1個） 玻棒（1個） 燒杯(300 ml5個)試劑：乙酸乙酸鈉緩沖液（0.2mol/L,pH5.0）磷酸緩沖液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5二硝基水楊酸氫氧化鈉 冰醋酸 丙三醇 戊二醛 無水乙醇 濃鹽酸 果膠酶 果膠 半乳糖醛酸 殼聚糖 蒸餾水若干桶四、方法步驟1 載體的制備1.1取殼聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，

4、加20ml甘油攪拌溶解，制得殼聚糖溶液。1.2每組配制60ml 10%的NaOH溶液,均分到三個小燒杯中。用注射器吸取約3ml殼聚糖的溶液滴入10%的NaOH溶液中，即得到殼聚糖的微珠。每組共做三份相同量的微珠，靜置10min，蒸餾水浸洗至中性，最后三份微珠各用20ml pH7.0的磷酸緩沖液浸洗一次（3min）。1.3傾去磷酸緩沖液，進行下面步驟。2 載體的活化三份載體中各加入4%的戊二醛溶液約20ml，過夜或者室溫活化5h，中間搖動。3 偶聯(lián)3.1取果膠酶0.1g，加入18ml水、2ml乙酸乙酸鈉緩沖液，搖床上振蕩提取5h，8000rpm離心10min，上清液即初始酶液，留2ml酶液置于一

5、支干凈的5ml離心管中4備用，其余18ml酶液進行下面實驗。3.2水洗除去游離戊二醛（5min5次）。3.3將活化的三份載體合并，用所剩酶液覆蓋載體，4過夜，中間搖動幾次。4 活性的檢測4.1水洗除去游離酶（2min4次），回收在小三角瓶中的濾液即殘余酶液置于4備用。收集小球，濾紙吸干，稱重。另取兩份各20粒微珠，各自稱重，4保存?zhèn)溆谩?.2取兩支試管編號按下表所述步驟加樣，進行固定化酶的酶活測定(20粒固定化酶顆粒稱重)：操作步驟對照管反應(yīng)管10.4果膠4ml50水浴中預(yù)熱5min0.4果膠4ml50水浴中預(yù)熱5min 23ml pH5.0乙酸乙酸鈉緩沖液3ml pH5.0乙酸乙酸鈉緩沖液3

6、50準(zhǔn)確反應(yīng)2h加入完整的固定化酶顆粒20粒50準(zhǔn)確反應(yīng)2h4立即置于沸水浴中，快速加入完整的固定化酶顆粒20粒5沸水浴中煮沸5min立即置于沸水浴中煮沸5min4.3游離酶的酶活測定取兩支試管編號甲乙管按下表加樣：操作步驟甲管乙管10.4果膠4ml50水浴中預(yù)熱5min0.4果膠4ml50水浴中預(yù)熱5min 22ml pH5.0乙酸乙酸鈉緩沖液2ml pH5.0乙酸乙酸鈉緩沖液3加入初始酶液2ml50準(zhǔn)確反應(yīng)2h加入殘余酶液2ml50準(zhǔn)確反應(yīng)2h4立即置于沸水浴中煮沸5min立即置于沸水浴中煮沸5min4.4定性實驗：取兩支試管分別加入對照管和反應(yīng)管上清液各1ml，再分別各加入2ml無水乙醇

7、(含1的濃鹽酸)，靜置15min，觀察兩管有什么現(xiàn)象出現(xiàn)？為什么？4.5酶活力測定步驟：4.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作精確稱取0.1000g半乳糖醛酸,用緩沖液定容至100mL,獲得1mg/mL的半乳糖醛酸溶液。取6支25mL的刻度試管編號,并按表1加入各種試劑。表1 標(biāo)準(zhǔn)樣配制試劑mL試管號1 2 3 4 5 6糖標(biāo)準(zhǔn)液(mgmL-1)00.20.61.01.21.6蒸餾水3,5-二硝基水楊酸5.05.05.05.05.05.0半乳糖醛酸含量mg00.20.61.01.21.6加入試劑后在混合振蕩器上振蕩均勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即用流水冷卻，加蒸餾水定容至25mL(以1號試管作為空白調(diào)

8、零)，在540nm波長下比色測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.5.2另取兩支試管分別加入對照管和反應(yīng)管上清液各2ml，再分別加入3，5二硝基水楊酸5ml，沸水浴保溫5min,取出立即冷卻。觀察兩管溶液顏色發(fā)生了什么變化？為什么？加蒸餾水定容到25mL。以標(biāo)準(zhǔn)空白為基準(zhǔn)調(diào)零，在540nm處測吸光度(吸光度要在0.0250.4之間,否則重新稀釋)。4.5.3另取兩支試管分別加入甲管和乙管上清液各2ml，再分別加入3，5二硝基水楊酸5ml，沸水浴保溫5min,取出立即冷卻。觀察兩管溶液顏色發(fā)生了什么變化？為什么？加蒸餾水定容到25mL。以標(biāo)準(zhǔn)空白為基準(zhǔn)調(diào)零，在540nm處測吸光度(吸光度要在0.0250.4之間,否則重新稀釋)。五、結(jié)果分析1.酶活力單位：酶在50、pH5.0的條件下,1h分解果膠產(chǎn)生1mg游離半乳糖醛酸為1個果膠酶活力單位。同理將緩沖液體積固定為3mL，將固定化果膠酶體積忽略，進行固定化果膠酶的活力測定。2.酶活力計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線