1、動物細胞工程實驗,傳代培養(yǎng)及細胞計數(shù),實驗目的,掌握傳代培養(yǎng)的一般方法和步驟以及培養(yǎng)過程中的無菌操作技術。 熟悉培養(yǎng)細胞的觀察方法。 學習血球計數(shù)板的計數(shù)方法。,實驗原理,細胞在培養(yǎng)皿長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分皿就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分皿。,實驗用品,儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37）、培養(yǎng)皿、超凈工作臺、倒置相差顯微鏡。 材料：卵巢癌細胞HO-8910。 試劑：1640培養(yǎng)基（含血清10%）、0.25%胰蛋白酶、75%

2、消毒酒精。,實驗步驟,實驗前將無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基分裝并進行溫育（37）。,以溫度計實際顯示溫度為準！,實驗步驟,將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。,實驗步驟,用不含血清1640培養(yǎng)基沖洗細胞。,實驗步驟,將無血清培養(yǎng)基吸出，加入0.25胰蛋白酶溶液1ml，使細胞都浸入溶液中。,實驗步驟,消化30-40s后，棄去胰酶，加入含血清1640培養(yǎng)基2ml，終止消化，并充分吹打。吹打后將懸浮起來的細胞轉移到15ml離心管中，1000rpm離心5min。,實驗步驟,離心后，棄上清，加含血清1640重懸，混勻，取50ul用于細胞計數(shù)。,實驗步驟,血球計數(shù)板的計數(shù)原理,實驗步驟,根據(jù)細胞計數(shù)的結果

3、，用含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度到1X105個/ml。分至兩個培養(yǎng)皿中，做好標記，繼續(xù)培養(yǎng)。,實驗完畢，將培養(yǎng)基瓶口迅速過酒精燈火焰消毒，擰緊后，封口膜密封。拿出超凈臺，放入冰箱。 實驗后，請將超凈工作臺內(nèi)擦拭干凈，酒精噴灑消毒，并將酒精擦干凈，打開紫外燈滅菌。用過的離心管和血球計數(shù)板須清洗干凈。 各個實驗小組的同學負責將垃圾帶走，值日生打掃實驗室衛(wèi)生。,實驗步驟：9、實驗后的整理工作,實驗報告,試述傳代培養(yǎng)的步驟和注意事項，并指出哪些是關鍵步驟。 傳代培養(yǎng)時要注意嚴格的無菌操作，并防止細胞之間的交叉污染。 酶解消化要適度，消化過度會對細胞造成損害，消化不夠則難于將細胞解離下來。 傳代后第2-3天觀察細胞生長情況，了解細胞是否健康生長：健康細胞的形態(tài)飽滿，折光性好。 掌握好代傳代時機：健康生長的細胞生長致