1、抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則A_m2%Mv&g0eJl1gg*L0一、基本原則nj%bg)01. 抗腫瘤藥物分類我的研究-5-首頁IY1i dCX9ga(1) 細(xì)胞毒類藥物(cytotoxic agent)：包括干擾核酸和蛋白質(zhì)合成、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶及作用于微管系統(tǒng)的藥物等；我的研究-5-首頁:G;I:sd l Tk(2) 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biological response modifier)；G8JUhCM0(3) 腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑(resistance reversal agent)；,q2 最新 WORD s-o-MG0(4) 腫瘤治療增敏劑(oncotherap

2、y sensitizer)；4R4wnD0F0(5) 腫瘤血管生成抑制劑(tumor angiogenesis inhibitor)；我的研究-5-首頁q tX&ojXN(6) 分化誘導(dǎo)劑(differentiation inducing agent)；R_v!h$S? G3z D0(7) 生長因子抑制劑(growth factor inhibitor)；我的研究-5-首頁A!Ro+Y1m6eIn(8) 反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide) 。我的研究-5-首頁9b B/aj4W&n:d;uq3z02. 抗腫瘤藥物藥效學(xué)需

3、研究內(nèi)容%|eoB,S3Q!X)T F02.1 包括體外抗腫瘤試驗，體內(nèi)抗腫瘤試驗。我的研究-5-首頁hNn0rYG2.2 評價藥物的抗癌活性時，以體內(nèi)試驗結(jié)果為主，同時參考體外試驗結(jié)果以做出正確的結(jié)論。我的研究-5-首頁j0B2AQ MS,p K2.3 I類抗腫瘤新藥應(yīng)進(jìn)行藥物作用機(jī)制初步研究。 我的研究-5-首頁XJ2T0 IF我的研究-5-首頁_.tbK Bh(y2I二、體外抗腫瘤活性試驗我的研究-5-首頁*-f t!L.S,k1. 試驗?zāi)康?我的研究-5-首頁H0y!?_7O5N9af3C)1.1 對候

4、選化合物進(jìn)行初步篩選；我的研究-5-首頁t!X;S.,kA/U|y9p1.2 了解候選化合物的抗瘤譜；,LnG5jDT01.3 為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等 。 q ;*wx Yl0我的研究-5-首頁o JtUTVo X9Z2. 試驗方法5o$Q Kd3O P0選用10-15株人癌細(xì)胞株，根據(jù)試驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)細(xì)胞系及適量的細(xì)胞接種濃度，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)；推薦使用四氮唑鹽MTT還原法、XTT 還原法、磺酰羅丹明B染色法、或51Cr釋放試驗、集落形成法等測定藥物的抗癌作用。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時間一般為48-72 小時，貼壁細(xì)胞需先貼壁

5、24 小時后再給藥。試驗應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照組，陽性對照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對照為溶媒對照。 enE0iW1yk0我的研究-5-首頁4u8H?QnHs;,A3. 評價標(biāo)準(zhǔn)我的研究-5-首頁 NF 2c-t0K$N以同一樣品不同濃度對腫瘤細(xì)胞抑制率作圖可得到劑量效應(yīng)曲線，然后采用Logit法計算半數(shù)有效濃度(IC50值或EC50值)。體外試驗至少重復(fù)一次。我的研究-5-首頁o?0Pe1DuT4l我的研究-5-首頁+ih sEPbkB附注：評價藥物抗癌活性的方法：65Pyc4To%v1c01.MTT還原法我的研究-5-首

6、頁 fxQ Z?rQ,Q1.1 基本原理： #?h#E+1U mZt$w.cy0四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一種能接受氫原子的染料?；罴?xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲月替 (formazan)，而死的細(xì)胞則無此功能。用二甲基亞諷(DMSO)溶解甲月替后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。GNke1L L7M lOe601.2 操作步驟:我的研究-5-首頁pH$ZZG!M&x:CZ j1.2.1選用

7、對數(shù)生長期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，用含10小牛血清的RPMI l640培養(yǎng)基配成5000個ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200l，37，5CO2 培養(yǎng)24 h。+K0I)p bs:D;b0rdl01.2.2 實驗組換新的含不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基，對照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)35平行孔，37，5CO2 培養(yǎng)45 d。s!W6d1_|01.2.3 棄去上清液，每孔加入200 l新鮮配制的含0.2 mgml MTT的無血清培養(yǎng)基37繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄上清，并加入200 l DMSO，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗波長為570 nm，參比波長為450 n

8、m測定光密度值。我的研究-5-首頁9g6q m5t1.3 結(jié)果評定:YoW20按下式計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：?|O4f8n0腫瘤細(xì)胞生長抑制率(1- OD實驗/OD對照) 100hX9MwzIC0fEm0以同一樣品的不同濃度對腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出樣品的半數(shù)殺傷濃度IC50。合成化合物或植物提取純品的IC5010 gm1或植物粗提物的IC5020 gm1時，則判斷樣品在體外對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。我的研究-5-首頁 DDW_gE5EAl$P.n+_02. 生長曲線法的基本原理：5cX EI3OMK0在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈

9、指數(shù)生長，如取細(xì)胞數(shù)的對數(shù)與培養(yǎng)時間作圖可得一條直線，故稱此時為對數(shù)生長期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營養(yǎng)物的消耗，細(xì)胞生長逐漸減慢以致停止，此時稱高坪期或穩(wěn)定期。因此藥物對細(xì)胞生長的影響可通過生長曲線反映出來。#h,yw1w2n0我的研究-5-首頁$U oS;Z+t(O&LH3. 染料排斥試驗的基本原理：我的研究-5-首頁V5G,7A7j:w活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺盼藍(lán)、苯胺黑等的能力，而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞，可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入這些染料，一定時間后，對著色和未著色的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，即可算出被殺死的細(xì)胞比例。我的研究-5d19

10、.com-首頁P(yáng)g+J/K&S2y tAP8aID 8|04. 集落形成法的基本原理：Nd8o e!eo0克隆原細(xì)胞具有持續(xù)增殖能力，當(dāng)單個細(xì)胞分裂6代或6代以上時，其后代所組成的群體(集落)便含50個以上細(xì)胞。通過集落計數(shù)可對克隆原細(xì)胞作定量分析。它反映了單個細(xì)胞的增殖潛力，故能較靈敏地測定抗癌藥的活性，日前被認(rèn)為是一種較理想的檢測方法。常用的集落形成法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng)法兩種。我的研究-5-首頁p0UnHtfv x du.r:qt05. SRB法的基本原理：我的研究-5-首頁 TgZw UDSRB(sulforhodamine 是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色

11、，可溶于水。 SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合。其在515 nm波長的OD讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。MTT法的一個缺點(diǎn)是OD值可隨放置時間而變，而SRB法無此現(xiàn)象。因此更適用于進(jìn)行大規(guī)模的試驗。3Hj $o+PLk0三、體內(nèi)抗腫瘤試驗9eoVh/r. n 0體內(nèi)抗腫瘤試驗必須選用三種以上腫瘤模型，其中至少一種為人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。試驗結(jié)果三種模型均為有效，再重復(fù)一次也為有效，評定該化合物對這些實驗性腫瘤具有治療作用。 我的研究-5-首頁$P: Fq0B&b鼓勵使用人類腫瘤裸鼠移植瘤模型和多種類的移植瘤模型、原位接種模型和中空纖維測

12、定(hollow-fiber assay)等方法。%fu.pa(l0我的研究-5-首頁,K/DP.e4Xh1. 動物0w7ZY2z0動物要求健康，符合等級動物要求，有實驗動物合格證。雌雄均可，但同一批實驗中動物性別必須相同。小鼠鼠齡為5-6周，體重為18-22克。評價同一物質(zhì)的活性時，不同批次的實驗必須采用同一品系的小鼠。 我的研究-5-首頁,Z&Cbb$J)Z我的研究-5-首頁Urhs#odV/2. 腫瘤模型我的研究-5-首頁 P g)a#TB;U:f)vd2.1 小鼠腫瘤模型 我的研究-5-首頁.g|/L.RI+D u淋

13、巴細(xì)胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宮頸癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、網(wǎng)織細(xì)胞瘤M5076、腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各種小鼠腫瘤的亞型和耐藥株等。 我的研究-5-首頁-G2kG&M o?vB.bF76xK9v u G|02.2 人癌裸小鼠移植瘤模型 我的研究-5-首頁G,XB4k(bZ(|6a應(yīng)選用體外試驗敏感細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)抗人癌裸小鼠移植瘤試驗。 模型建立和使用應(yīng)注意：我的研究-5-首頁U z1ueqqQ)da(1)移植瘤一般由相應(yīng)的細(xì)胞株移植而建

14、立，對細(xì)胞株和移植瘤的化療敏感性應(yīng)予了解。.ww+rX abFN0(2)移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳2-3代后再用于體內(nèi)抗腫瘤試驗。#H;/X0U;tkG0(3)對模型生長情況應(yīng)全面了解，尤其是生長快的模型我的研究-5-首頁2t TI4j+iyq(4)為了保持移植瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性，復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應(yīng)少于 15-20代 5F#%M/p(H-Tjj H*|0我的研究-5-首頁$?+Y l eH3. 試驗過程QDhM|*L:_ HKB03.1 接種：我的研究-5-首頁5V$s8e%PW腫瘤接種方法主要有皮下接種、腹腔接種和原位接種。 我的研究-5d19.

15、com-首頁k+P%66YB%l3.1.1 皮下腫瘤模型我的研究-5-首頁1A5LmMWD.l7l:R選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在無菌條件下（超凈臺或接種罩），用碘酒、酒精或新潔爾滅消毒動物皮膚，切開皮膚，剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5 mm3左右，用套管針接種于動物一側(cè)或雙側(cè)腋窩皮下；或制成細(xì)胞懸液，然后按一定比例加入無菌生理鹽水，一般每只小鼠接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為（1-5）106。 我的研究-5-首頁3w&|Lb)g我的研究-5-首頁:m Bm$T/d3.1.2 腹水瘤模型我的研究-5-首頁a/f G$Kl#N ws

16、 Tzq無菌條件下，消毒動物皮膚，吸取生長良好的動物腹水，以生理鹽水按一定比例稀釋后接種于動物腹腔，接種細(xì)胞數(shù)量一般為（1-5）106。i$S3J,G6cN)04To-mr#D(w 03.1.3 原位接種模型s#ZEl |k P0原位接種是指將來源于某臟器的腫瘤接種在動物的某臟器，如將人肝癌接種在裸小鼠的肝臟。原位接種不是常規(guī)的方法，但有其優(yōu)越性，是鼓勵使用的方法。主要有肺、肝、胃、腸、乳腺、顱內(nèi)等原位接種方法。我的研究-5-首頁|ajVx我的研究-5-首頁j&O%zxs3.2 動物分組y Wm+E$H.JG03.2.1 試驗設(shè)陰性對照組、陽性對照組、治療組。w;f

17、.PEfm2h-a03.2.2 治療組設(shè)高、中、低三個劑量組。小鼠腫瘤和腹水瘤接種后次日將動物隨機(jī)分組，裸鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100300mm3后將動物隨機(jī)分組。我的研究-5-首頁:K1D|qo EM O3.2.3動物數(shù)普通小鼠每組10只，裸鼠6只。 陰性對照組動物數(shù)為治療組動物數(shù)實驗組數(shù)1/2我的研究-5-首頁D;yExC+d我的研究-5-首頁-jDhmRmS 3.3 劑量設(shè)置qz+|%Pb n nt/S3w03.3.1 治療組設(shè)高、中、低劑量治療組，一般按4:2:1設(shè)置，高劑量使用最大耐受量或LD10的劑量。TQI%n+d

18、s8 +03.3.2陰性對照組給予相應(yīng)的溶劑；我的研究-5-首頁)S ta(S.x.L3.3.3陽性對照藥選用對該動物敏感的、臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物，Y1xL N|Id+D03.3.4如受試物為一抗癌藥物的衍生物或類似物時，必須選用該抗癌藥物作為陽性對照藥。 我的研究-5-首頁K Y6Z lB:c0!F我的研究-5-首頁:V9F#gE/uu13.4 陽性對照藥選擇原則Nm9I|k2H2c;v/G0療效確切；與被試物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)類似；與被試物質(zhì)有類似的作用機(jī)理。aO mEww40te vBT$O.y03.5 藥物配制7x2J#JI#3P+G.R0溶于水的藥物

19、，用生理鹽水或蒸餾水配制；如用酸、堿溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5N HCl)或堿(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，調(diào)節(jié)pH在4.5-9.0的范圍內(nèi)。用乙醇、丙二醇、吐溫80、DMSO助溶的藥物，或用吐溫60、吐溫80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纖維素制成混懸液的藥物，可腹腔注射或口服，但必須設(shè)相同濃度的溶劑對照組。用注射用花生油配制的溶液或乳劑可口服、皮下或肌肉注射。我的研究-5-首頁q+g5Jo.OasWpg P:tdY|G03.6 給藥方案和給藥途徑我的研究-5-首頁qvPd(Afn分組當(dāng)日開始給藥，根據(jù)不同藥物的代謝動力學(xué)和毒性反應(yīng)等確定

20、給藥方案。給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同。 給藥次數(shù)較多，或被試物質(zhì)溶解性較差，靜脈給藥有困難時，可考慮使用腹腔給藥，但在評價藥效時要注意這兩種給藥途徑是有差別的。 可采取瘤周、瘤內(nèi)、肌肉、皮下給藥途徑。腹水瘤試驗時一般不能應(yīng)用腹腔給藥途徑。 Eb/Q$Q$?g.x0&F0我的研究-5-首頁v:x2Kp$8d3Y oG4 評價標(biāo)準(zhǔn) &CY|gX04.1 腹水瘤模型我的研究-5-首頁#f0Cf#V%cg接種給藥后，觀察和記錄動物死亡時間，計算生存天數(shù)。如陰性對照組20%動物存活時間超過4周，表明腹水瘤生長不良，實驗作廢。1ICMzo5k%zz:L0采用中位生存時間

21、（即median survival time,MST）來評價每組的生存時間 ，其計算公式為： 我的研究-5-首頁:sfgEQJ:我的研究-5-首頁J+b.C7GA l(t每組鼠數(shù)的中間數(shù)-中間生存天數(shù)前死亡的鼠數(shù)我的研究-5-首頁(m|;d(s I(apMST=（中間生存天數(shù)-0.5）+0inG0中間生存天數(shù)死亡的鼠數(shù)我的研究-5-首頁sEV(|4u!jb8HKb|.Y$Hg0治療組與對照組的比較，采用T/C（%）來表示，計算公式為：&Jw&F j4c5Q.af:P0 T MST我的研究-5-首頁5s,nM+yK!P4 MH

22、x$ xT/C % = 100%我的研究-5-首頁/w*Ezx-F C MST我的研究-5-首頁w,H J*E:_ r.FT MST：治療組MST ；C MST：陰性對照組MST。我的研究-5-首頁0t+X5F+|1Bst評價標(biāo)準(zhǔn)以125%為界，當(dāng)T/C%125% 時。視為有效，反之則無效。我的研究-5-首頁(a Q qG/n9+E%XX/NmUG04.2 裸鼠移植瘤模型f!L:d9X3q0推薦使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察受試物抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤直徑的測量次數(shù)根據(jù)移植瘤的生長情況而定，一般為每周2-3次,每次測量同時還需稱鼠重。 W-Xh

23、zv4p$mq7D0腫瘤體積(tumor volume,TV)的計算公式為：i/X7Zs V;x v4D0V = 1/2ab2 或/6abc我的研究-5-首頁 )E%A0ZQ其中a、b、c分別表示長寬高。兩公式的相關(guān)性極好，可采用任一公式。:n(Y9XA p0根據(jù)測量結(jié)果計算出相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV）， RTV = Vt / V0。其中V0為分籠給藥時(即d0)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。我的研究-5-首頁5hQ P7hr8k&Y9|抗腫瘤活性評價指標(biāo)為相對腫瘤增殖率T/C（%）我的研究-5

24、-首頁+jrEj,V)Nyb|d我的研究-5-首頁-cQ;o&pR&Vh TRTVE N-V)9F0T/C % = 100%我的研究-5-首頁)yKy1x0ow:K CRTV_U!u(N%Gx kX b8T l,p%tb)e0;b#NJ fSs;g7q0TRTV：治療組RTV ；CRTV：陰性對照組RTV。我的研究-5-首頁Y3P3vz.Qw-k療效評價標(biāo)準(zhǔn)：T/C % 40 %為無效；T/C % 40%，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P0.05為有效。 我的研究-5-首頁h0F/A O7C9nd%rToA Dza6i_04.3 小鼠腫瘤模型0G yQh

25、%xz)k0生長較慢小鼠腫瘤采用與裸鼠移植瘤同樣的測量瘤徑的評價方法。D E ffdNE%B0生長較快小鼠腫瘤可采用稱瘤重的方法評價。試驗結(jié)束后處死動物，稱體重，解剖剝離瘤塊，稱瘤重。陰性對照組腫瘤平均瘤重小于1克，或20%腫瘤重量小于400毫克，表示腫瘤生長不良，試驗作廢。我的研究-5-首頁e#S8j/U0U療效評價公式：Y1h/cy|/YA0 給藥組平均瘤重-陰性對照組平均瘤重le hm#nL.LF,f0腫瘤生長抑制率 = 100%L0c(Pj D0 陰性對照組平均瘤重 我的研究-5-首頁$8e:?b!X kSw我的研究-5-首頁P(yáng)b37dd,T&nP#x8TY?評價標(biāo)準(zhǔn)：%c%EP0y;x0N0腫瘤生長抑制率40% 為無效；腫瘤生長抑制率40%，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P50%我的研究-5-首頁w6RMW2O（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：T6w4u%V2iu _l0可在光學(xué)顯微鏡與電鏡下觀察候選化合物作用后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，對照組的早幼粒細(xì)胞應(yīng)90%-95%，候選化合物組細(xì)胞分化，成熟粒細(xì)胞占比例越高，說明該化合物的分化效果越好。我的研究-5-首頁fXA.MY;5.1.2實體瘤細(xì)胞的分化誘導(dǎo) 我的研究-5-首頁)L |s&nsf+u*N q,W2常用細(xì)胞株：人肝癌HepG2、SMM