1、項目十六 免疫細(xì)胞的分離一、抗凝血的制備 【實驗原理】常用的抗凝劑如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和檸檬酸能與Ca2+結(jié)合；機械脫纖維使血液中血小板和纖維蛋白凝聚；從而都能阻止血液凝固。實驗室常用的抗凝方法有如下幾種：肝素抗凝、EDTA抗凝、脫纖維抗凝及Alsever液抗凝等方法?！驹噭┖推鞑摹?試劑肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理鹽水等。2器材三角燒瓶、玻璃珠、試管或離心管、采血器具?！静襟E和方法】1肝素抗凝法將肝素用生理鹽水配制成250U/ml或其它濃度的溶液，115滅菌10min(或11215min)，置-20可保存數(shù)月。實驗中常用的肝素抗凝濃度為2050

2、U/ml血液，實際當(dāng)肝素濃度為510U/ml血液時已顯出良好的抗凝效果。2EDTA法常用EDTA二鈉鹽(EDTA-Na2)，用生理鹽水配制成濃度為27g/L的溶液。配制時將溶液調(diào)至pH7.2，否則EDTA-Na2不溶解。用時取0.05ml即可使1ml血液抗凝。EDTA-Na2有效抗凝濃度為12mg/ml血液。3脫纖維法在三角燒瓶中放入一些小玻璃珠(放入數(shù)目視采血量多少而定，通常放3040粒)，將血采入后立即輕輕順一個方向旋轉(zhuǎn)，直到血纖維凝聚為止。4Alsever液抗凝法血液與Aalsever液混合比例為1:11:2?！窘Y(jié)果判定】除玻璃珠脫纖維法有血纖維凝聚之外，抗凝血中不能有血凝塊出現(xiàn)，否則應(yīng)

3、重新制備?！咀⒁馐马棥?采血所用器具、抗凝劑、操作過程均應(yīng)無菌。2加入血液后應(yīng)輕輕混合，直到與抗凝劑均勻混合為止。常采用旋轉(zhuǎn)混合的方法混勻。3抗凝血放4保存?！痉椒ㄔu價】肝素制備的抗凝血不易長期保存(保存時間12h)。EDTA 法能保持血小板與白細(xì)胞的正常形態(tài)，避免聚集。脫纖維法可使少量淋巴細(xì)胞丟失，但是懸液中細(xì)胞活力好，而且血小板污染甚少。Alsever可較長時間保存血液，一般可保存23周?！九R床意義】抗凝血的制備是實驗室常用的基本技術(shù)之一，在免疫試驗及血細(xì)胞的檢測中被廣泛利用，是醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)學(xué)生必須掌握的基本技能之一?！舅伎碱}】1實驗室血液抗凝法有哪些？抗凝的原理如何？2不同抗凝法有何特點

4、？試設(shè)想不同試驗中應(yīng)如何選擇抗凝方法？ 二、外周血中免疫細(xì)胞的分離(Extrication of immunocyte from peripheral blood)(一) 白細(xì)胞制備 【實驗原理】血液中白細(xì)胞的分離方法常用自然沉降法或利用高分子聚合物加速紅細(xì)胞沉降的方法來分離白細(xì)胞。因血液中紅細(xì)胞的密度比其它血細(xì)胞密度大，故紅細(xì)胞沉降率較快，而且高分子聚合物能使紅細(xì)胞凝聚成串錢狀，加速其沉降，故而從血漿層中可分離到白細(xì)胞。只介紹60g/L右旋糖酐沉降法?！驹噭┖推鞑摹?60g/L右旋糖酐取右旋糖酐(dextran，分子量200400kDa)6g，加生理鹽水至100ml溶解，115滅菌15min

5、，備用。2其它試劑無Ca2+、Mg2+ Hanks液。3器材試管、吸管、吸頭、離心機等。【步驟和方法】 取適量抗凝血加入等量60g/L右旋糖酐，輕輕混勻，直立或45角傾斜，置室溫或37 30min。取出血漿層，用無Ca2+、Mg2+ Hanks液洗滌3次，每次2000r/min離心10min。按實驗要求配成所需濃度，通常為2106個細(xì)胞/ml?！窘Y(jié)果判定】 此法分離的白細(xì)胞中含60%70的淋巴細(xì)胞，同時也含較多的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板及少量的紅細(xì)胞?！咀⒁馐马棥?加速沉降時間不能超過30min，自然沉降時間不能超過60min，否則淋巴細(xì)胞也會沉積，使收獲率降低。2混雜的紅細(xì)胞可用NH4Cl溶

6、液溶解，離心去除。3吸取血漿層時，也可將紅細(xì)胞層上的白細(xì)胞層收獲，雖然白細(xì)胞收獲率高，但是紅細(xì)胞的污染率也增高?！痉椒ㄔu價】加速紅細(xì)胞沉降的方法除本法之外，還有30g/L明膠生理鹽水、35g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量25kDa)生理鹽水、或10g/L甲基纖維素等分離方法。這些方法簡便，細(xì)胞收獲率比自然沉降法高。明膠沉降法會增加白細(xì)胞粘性，對實驗有一定影響。自然沉降法所得細(xì)胞損傷最小?！九R床意義】沉降法制備的白細(xì)胞懸液，可用于許多細(xì)胞免疫試驗，但是由于懸液中含中性粒細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞較多，因此在淋巴細(xì)胞增殖試驗、組織配型等試驗中不宜使用，否則會使結(jié)果出現(xiàn)較大誤差，甚至出現(xiàn)錯誤。也可進一

7、步用于其它免疫細(xì)胞的分離?！靖健考t細(xì)胞溶解(NH4Cl)法1NH4Cl溶解緩沖液配制 NH4Cl 8.29g (或8.3g) KHCO3 1.09g (或1.0g) EDTA-Na2 37.0mg 蒸餾水加至100ml，溶解后置28保存。用時用PBS(配制：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO47H2O 2.16g，NaCl 8g，NaN3 0.5g，蒸餾水1000ml；0.01mol/L)或蒸餾水稀釋10倍，pH在7.37.4(不在此范圍應(yīng)調(diào)整pH)，室溫保存，1周內(nèi)使用，過期作廢。2溶解方法(1)按每310ml血液分離的白細(xì)胞懸液加入5ml NH4Cl溶解緩沖液比例混合(

8、如直接溶解血液中紅細(xì)胞應(yīng)按0.51ml血液加入14ml溶解液比例混合)。(2)置室溫35min，然后立刻離心，離心速度10002000r/min，離心時間應(yīng)小于10min，去上清。(3)用Hanks液(或其它緩沖液、培養(yǎng)液)至少洗滌次，按實驗要求配制成所需濃度。注意溶解時間不要超過5min，否則會有部分白細(xì)胞破壞；溶解后立刻離心，洗滌。 【思考題】 加速紅細(xì)胞沉降的方法有哪些？其原理如何？(二) 單個核細(xì)胞制備【實驗原理】血液中單個核細(xì)胞的分離常采用密度梯度離心法(density gradient centrifugation)。單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，人外周血單個核細(xì)胞的密度為1.

9、0501.077，而粒細(xì)胞和紅細(xì)胞的密度在1.0801.110。利用密度為1.0770.001的分層液，將待分離的細(xì)胞懸液小心鋪于其上，經(jīng)離心后單個核細(xì)胞懸浮于分層液上層界面，而紅細(xì)胞與粒細(xì)胞沉于管底?！驹噭┖推鞑摹?聚蔗糖-泛影葡胺分層液(密度為1.0770.001) 已有商品供應(yīng)或自己配制。25g/L臺盼藍(lán)配制方法見附錄。3肝素250U/ml溶液，用Hanks液配制。4Hanks液。5刻度離心管、吸管、滴管、血細(xì)胞計數(shù)板、載玻片、蓋玻片。6水平離心機、顯微鏡?！静襟E和方法】1取靜脈血2ml，加0.2ml肝素溶液抗凝，作白細(xì)胞計數(shù)和分類計數(shù)。之后，再加入等量Hanks液，混勻。2取2ml分層

10、液置于離心管中，將稀釋血液沿管壁緩緩疊加于分層液上，形成清晰界面。稀釋血液與分層液的容積比例以2:13:1為宜。3置水平離心機中離心2000r/min 20min。4離心后從離心管底部到液面分為五層，依次為紅細(xì)胞沉淀層、粒細(xì)胞層、分層液層、白霧狀單個核細(xì)胞層、血漿層(含血小板和破碎細(xì)胞)，見圖3-1。圖3-1 聚蔗糖-泛影葡胺分層液離心后外周血細(xì)胞分布示意圖5用滴管直接吸出單個核細(xì)胞層，或吸去血漿層后再吸出該層，置于另一離心管中。6加入5倍量以上的Hanks液，充分混勻，離心1000r/min 10min。離心后傾棄上清液，再用Hanks液洗滌2次。7用含1020滅活小牛血清的Hanks液或培

11、養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液。計數(shù)，并分別計數(shù)粒細(xì)胞和單個核細(xì)胞數(shù)，同時用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力，最后按實驗要求將細(xì)胞懸液調(diào)整到適當(dāng)濃度?！窘Y(jié)果判定】 1細(xì)胞回收率()分離后所得細(xì)胞懸液量(ml)懸液中單個核細(xì)胞數(shù)/ml/ 原全血量(ml)原全血中單個核細(xì)胞數(shù)/ml100。2淋巴細(xì)胞純度()分離后淋巴細(xì)胞總數(shù)/分離后白細(xì)胞總數(shù)100?！咀⒁馐马棥?溫度變化可直接影響分層液的密度，即影響細(xì)胞的收獲率和純度。故應(yīng)在室溫(1828)下進行實驗，分層液使用前應(yīng)預(yù)溫至室溫。2分層液應(yīng)直接加入管底，防止浸沾四周管壁。3將細(xì)胞懸液疊加于分層液上時務(wù)必小心，不要擾亂界面以影響分離效果。4分離時的轉(zhuǎn)速與時間應(yīng)根據(jù)不同標(biāo)本作

12、相應(yīng)調(diào)整。離心后若見白霧狀細(xì)胞層中仍摻雜紅細(xì)胞，應(yīng)提高轉(zhuǎn)速或延長離心時間；若淋巴細(xì)胞丟失過多，則應(yīng)適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速或縮短離心時間?！痉椒ㄔu價】本方法操作簡便、穩(wěn)定。細(xì)胞回收率達(dá)8090，單個核細(xì)胞純度可達(dá)95，淋巴細(xì)胞約占90%95，細(xì)胞活力可達(dá)95以上。但其中仍可混雜少量(約10)其它細(xì)胞?！九R床意義】該方法是目前最理想、最常用分離淋巴細(xì)胞的手段，其制備的細(xì)胞(主要是淋巴細(xì)胞)懸液已能滿足許多細(xì)胞免疫試驗要求，也可用于進一步制備T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞。故在細(xì)胞免疫試驗中有廣泛應(yīng)用，是細(xì)胞免疫檢測中最基本的技術(shù)之一?！靖健?聚蔗糖-泛影葡胺分層液的配制(密度1.0770.001) 1用雙蒸水將4

13、00g/L葡聚糖(Ficoll，分子量400kDa)溶液或干粉配成60g/L溶液，其密度為1.020。2用生理鹽水將600g/L或750g/L泛影葡胺(Urografin)配成340g/L溶液，其比重為 1.200。3取2份60g/L葡聚糖與1份340g/L泛影葡胺混合。4pH應(yīng)為7.27.4；一般偏酸，可用NaHCO3調(diào)整。5用波美比重計測密度應(yīng)為1.0770.001，如超出1.078，用60g/L葡聚糖溶液調(diào)節(jié)，如低于1.076，用340g/L泛影葡胺溶液調(diào)節(jié)。6過濾除菌，或112滅菌15min。置4保存?zhèn)溆茫话憧杀４?個月。 【思考題】 1為何常用密度為1.0770.001的分層液分離

14、人單個核細(xì)胞？ 2利用密度梯度離心法分離人單個核細(xì)胞，為何要將血液標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋，并要疊加于分層液上？(三) 淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞的分離【實驗原理】單核細(xì)胞有粘附玻璃和塑料表面的特性，而且它的密度與血液中淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞不同，故可利用粘附法或連續(xù)密度梯度離心法使單個核細(xì)胞懸液中的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分離、制備。此處只介紹平皿粘附法?！驹噭┖推鞑摹?試劑RPMI 1640培養(yǎng)液(含20滅活新生牛血清)、EDTA液(1mmol/L)。 2器材CO2培養(yǎng)箱(或燭缸)，倒置顯微鏡(或普通顯微鏡)、離心機、離心管、 吸管、滴管、玻璃平皿、血球計數(shù)板?！静襟E和方法】1將聚蔗糖-泛影葡胺分離的單個核細(xì)

15、胞洗滌3次，用RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到(24)106個細(xì)胞/ml。2將細(xì)胞懸液傾注入足夠大面積的無菌平皿中，于375CO2環(huán)境中靜置2h。3吸取未貼壁細(xì)胞，并用預(yù)溫至37的RPMI 1640培養(yǎng)液洗出未粘附細(xì)胞，重復(fù)洗滌23次，將這些液體合并，其中含淋巴細(xì)胞。 4于平皿中加入10ml EDTA，置37 5CO2條件下溫育10 min。再用吸管沖洗，使粘附細(xì)胞脫落，游離于液體中，并收集之。此為單核細(xì)胞收集液。5將未粘附和粘附細(xì)胞收集液分別用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次，每次離心1000 r/min 8min6檢查細(xì)胞活力，計數(shù)，按實驗要求調(diào)整細(xì)胞濃度?！窘Y(jié)果判

16、定】分類計數(shù)判斷分離細(xì)胞純度?！咀⒁馐马棥?1分離的單個核細(xì)胞應(yīng)4保存，溫度高，單核細(xì)胞易粘貼管壁，使之收獲率降低。最好用硅化玻璃試管保存。2若單個核細(xì)胞懸液中混雜較多紅細(xì)胞，應(yīng)預(yù)先用NH4Cl或其它低滲溶解法去除，否則會影響單核細(xì)胞貼壁。3延長粘附作用(如12h以上)可提高單核細(xì)胞收獲率。因為粘附時間短(幾個小時)不能使粘附力弱的細(xì)胞完成粘附作用；同時粘附的粒細(xì)胞不能在培養(yǎng)液中存活，延長時間會使其自行“消亡”。4培養(yǎng)液中血清濃度不宜低于20，因為血清能促進單核細(xì)胞粘附；另外，高濃度(20%40)血清可阻止B細(xì)胞粘附，從而提高分離純度。最好用自身血清， 若新生牛血清中存在天然的抗小鼠抗體，在分

17、離小鼠單核細(xì)胞時不宜采用；不要用多次凍融的血清。5試驗用溶液的pH值應(yīng)控制在7.2左右，不宜使用HEPES緩沖系統(tǒng)，因為單核細(xì)胞對HEPES很敏感?！痉椒ㄔu價】該方法簡便，不需特殊設(shè)備，是分離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞常用方法之一。同時用該法也可用于其它體液(如腹腔液)中巨噬細(xì)胞的分離。分離的單核細(xì)胞純度在85以上，可混雜少量淋巴細(xì)胞，尤其是B細(xì)胞。分離的淋巴細(xì)胞純度比聚蔗糖-泛影葡胺(密度1.0770.001)法更高，但該法更常用于分離單核細(xì)胞?！九R床意義】不僅淋巴細(xì)胞在免疫中有重要作用，而且單核細(xì)胞在抗原提呈、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等作用中也扮演重要角色。該法分離的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞被用于許多細(xì)胞免疫試驗，

18、以研究它們的免疫功能、抗腫瘤作用等?！靖健?1人外周血細(xì)胞在Percoll中的漂浮密度細(xì) 胞 漂浮密度(g/ml) 細(xì) 胞 漂浮密度(g/ml) 細(xì) 胞 漂浮密度(g/ml)紅細(xì)胞1.0901.110T、B淋巴細(xì)胞1.0621.077血小板1.0301.060嗜酸粒細(xì)胞1.0901.095NK細(xì)胞1.0501.070巨核細(xì)胞1.020 1.050中性粒細(xì)胞1.0801.085淋巴母細(xì)胞1.0431.067淋巴細(xì)胞1.0521.077單核細(xì)胞1.0501.066注：Percoll是經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處理過的硅膠微粒的商品名，是一種密度梯度分離介質(zhì)。2玻璃器皿的硅化方法(1)將玻璃器皿用清水洗凈，浸

19、泡洗液1618h，再用清水和蒸餾水沖洗，烘干。(2)用氯仿或庚烷配制的5二氯二甲硅烷(CH3)2SiCl2浸泡或涂刷,使之均勻涂布，放通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)至干。(3)用蒸餾水反復(fù)沖洗或180烘烤2h。硅化后的玻璃器皿可用45次，如滴水不能成珠應(yīng)重新硅化。此時應(yīng)先進行去硅處理，方法是將玻璃器皿浸泡于95酒精氫氧化鈉飽和溶液中1618h，到時用清水和蒸餾水沖洗干凈。硅化場所應(yīng)無灰塵。此方法也可用于硅化處理塑料制品?！舅伎碱}】 可利用單核細(xì)胞的哪些特性使之與淋巴細(xì)胞分離？(四)T淋巴細(xì)胞與B 淋巴細(xì)胞的分離【實驗原理】單核細(xì)胞和B細(xì)胞能吸附尼龍毛(nylon wool)。因此利用過尼龍毛柱的方法可將淋巴細(xì)胞

20、懸液中的T、B細(xì)胞分離?！驹噭┖推鞑摹?試劑Hanks液、新生牛血清。2器材(1)聚乙烯軟管(0.619cm)。(2)尼龍毛(進口聚酰胺纖維3d，或國產(chǎn)尼龍3d-6短纖維)。(3)吸管、滴管、試管、剪子、鑷子、封口鉗、離心機、溫箱?！静襟E和方法】1尼龍柱的制備(1)稱取尼龍毛5070mg，充分拉松散后浸入Hanks液中浸透。國產(chǎn)尼龍毛用0.2 mol/LHCl浸泡過夜，用大量蒸餾水沖洗，徹底去除酸液，然后置37烘干后方可使用。(2)將聚乙烯軟管熱封口一端成銳角，裝滿Hanks液。(3) 將浸透的尼龍毛均勻松散地裝入管內(nèi)約35cm (1518mg/cm)，管內(nèi)應(yīng)無氣泡。可置4過夜或冰凍保存，用前

21、融化。(4)管底剪約2mm開口，使液體呈滴狀通過(根據(jù)尼龍毛塞得松緊程度及下端開口大小來控制流速，約2ml/10s)。(5)用37預(yù)溫的10新生牛血清Hanks液洗滌34次，封口，再加入該液使其液面高于尼龍毛上端，立刻加入細(xì)胞懸液。2細(xì)胞分離(1)將淋巴細(xì)胞懸液用含10新生牛血清的Hanks液配制成濃度為1108個細(xì)胞/ml的懸液，取0.5ml垂直滴加，并使細(xì)胞懸液完全進入尼龍柱中。(2)于柱液上端加入0.5ml含10新生牛血清的Hanks液以防干涸，封開口，水平放置37溫育4560 min。(3)用25ml 37預(yù)溫的含10新生牛血清的Hanks液洗柱，收集最初5ml洗脫液，其中含大量T細(xì)胞

22、，其余20ml廢棄。 (4)一邊用手輕輕擠壓尼龍柱管壁，一邊用5ml含10新生牛血清的冷Hanks液洗柱，洗脫液中富含B細(xì)胞。(5)將所得T、B細(xì)胞懸液分別離心，傾棄上清液，用適當(dāng)液體重新懸浮，計數(shù)，備用?！窘Y(jié)果判定】對T、B細(xì)胞懸液分別計數(shù)。T、B細(xì)胞比例應(yīng)為5:15:2，如B細(xì)胞含量過多，說明可能被T細(xì)胞污染，或用熒光抗體法鑒定T、B細(xì)胞純度。本法分離的T細(xì)胞純度為80%90，B細(xì)胞可達(dá)70%85。細(xì)胞存活率在90以上?！咀⒁馐马棥?1尼龍柱裝的質(zhì)量對分離效果影響較大。尼龍毛應(yīng)疏松，不能打結(jié)、成團或有氣泡，否則T細(xì)胞不能完全洗出。沖洗時流速不能太快或太慢，以液滴快速自然滴下，但不能連成線為

23、準(zhǔn)。2加入的淋巴細(xì)胞數(shù)量不能超過1107/10mg 尼龍毛，否則T細(xì)胞純度不夠；但也不能太少，而使回收率降低。 3試驗用新生牛血清(或AB型人血清)均應(yīng)56 30min滅活。洗脫液中一定要含一定濃度的血清，一般以10% 20為宜，含量太高可使細(xì)胞凝聚。適當(dāng)增加洗脫液量也可減少T細(xì)胞污染，要求最后一滴洗脫液中無淋巴細(xì)胞。4擠壓尼龍柱時，一定要使柱內(nèi)充滿液體。用力不可過大，以免損傷B細(xì)胞及把吸附更強的單核細(xì)胞洗下，用力過輕使B細(xì)胞收獲率降低。5沖洗尼龍柱時注意洗脫液與柱溫應(yīng)保持一致。如溫度過低，吸附的細(xì)胞易脫落，不僅會影響T細(xì)胞的分離純度，也會減少B細(xì)胞的收獲率。 6分離的淋巴細(xì)胞懸液應(yīng)防止紅細(xì)胞

24、混入，也應(yīng)盡量避免粒細(xì)胞、血小板及單核細(xì)胞污染，否則會影響分離效果或?qū)嶒灲Y(jié)果(如細(xì)胞毒試驗中，粒細(xì)胞容易死亡而產(chǎn)生假陽性結(jié)果)。【方法評價】本法快速、簡便、重復(fù)性較好，分離的T、B細(xì)胞純度高，活力好，以T細(xì)胞尤為理想。分離的B細(xì)胞也比SRBC玫瑰花環(huán)方法制備的具有更好的分型反應(yīng)。因此是分離T、B 細(xì)胞普遍采用的方法。【臨床意義】分離的T、B細(xì)胞在細(xì)胞毒試驗、組織分型等試驗方法應(yīng)用較多，也可用于T、B細(xì)胞免疫功能方面的研究。 【思考題】 T、B淋巴細(xì)胞分離的方法有哪些？其原理如何？ 三、動物組織中免疫細(xì)胞的收集(Extraction of immunocyte cell from animal

25、tissue) 【實驗原理】淋巴細(xì)胞除存在于外周血中之外，主要分布于骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、脾臟和扁桃體中。不同功能的淋巴細(xì)胞在不同淋巴器官中的分布數(shù)量是不一樣的，多能干細(xì)胞主要存在于骨髓中，未分化和未完全分化的T細(xì)胞主要分布于胸腺中，成熟的T、B細(xì)胞在淋巴結(jié)、脾臟中存在數(shù)量較多，可根據(jù)實驗要求采集。此處僅介紹小鼠骨髓、胸腺、脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞懸液的制備方法?！驹噭┖推鞑摹?無菌室、超凈工作臺、離心機、顯微鏡。2剪刀、手術(shù)刀、鑷子、注射器及針頭、平皿、試管、吸管、鋼網(wǎng)(100 200目)。3含5新生牛血清的Hanks液，氯化銨溶解緩沖液。4小鼠【步驟和方法】(一) 骨髓細(xì)胞懸液的制備 1用頸椎脫臼法

26、將小鼠處死，消毒。取小鼠股骨和脛骨，將肌肉剝離去除。2將股骨或脛骨一頭剪掉，另一頭插入注射針頭，用注射器吸取Hanks液多次沖洗骨髓腔。3收集沖洗液，離心800r/min 10min，去上清。4重懸浮細(xì)胞，計數(shù)，按要求調(diào)整細(xì)胞濃度。(二) 胸腺淋巴細(xì)胞懸液的制備1取36周齡小鼠，將之處死。2用75%酒精消毒頸部和胸部皮毛。剝離皮膚，最露胸腔。于第5肋間胸腔中線處剪開，沿切口向上剪至胸骨柄上部。緩慢分離切口邊緣，可見胸腺左右葉蓋在縱隔胸膜下面。用鑷子夾住胸腺下端，另一鑷子夾胸腺成反折位，逐漸由下而上摘除胸腺。3剝離去除非胸腺組織，如脂肪、結(jié)締組織、血塊等。4將胸腺置于預(yù)先已加入35ml Hank

27、s液無菌平皿中的鋼網(wǎng)上，用注射器栓擠壓使細(xì)胞分離。 5自然沉降5min，棄去沉淀物，收集細(xì)胞懸液。離心800r/min 10min，去上清，重懸細(xì)胞，計數(shù)，按實驗需要調(diào)至所需濃度。(三) 脾和淋巴結(jié)細(xì)胞懸液的制備1將小鼠處死，消毒，將腹部皮膚剝離。2剖腹，取出脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，剝離去除非淋巴組織。3按胸腺細(xì)胞懸液制備程序收獲細(xì)胞懸液。4離心去上清，使細(xì)胞松散，加入2ml氯化銨溶解緩沖液溶解紅細(xì)胞。離心，洗滌，計數(shù)，按實驗需要調(diào)至所需濃度?！窘Y(jié)果判定】 1每只小鼠骨髓可收獲(5060)106個細(xì)胞。2每只小鼠胸腺可收獲(100200)106個細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)90以上。3每只小鼠脾臟可收獲(1

28、00200)106個細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)8090以上。4每只小鼠腸系膜淋巴結(jié)可收獲(50100)106個細(xì)胞，淺表淋巴結(jié)可收獲10106個細(xì)胞，存活率達(dá)80 90以上?！咀⒁馐马棥?制備培養(yǎng)用的細(xì)胞，全部制備過程均應(yīng)無菌操作。2應(yīng)用擠壓不要用研磨的方式來分離細(xì)胞懸液，動作應(yīng)輕柔，以保證細(xì)胞活力良好。3胸腺細(xì)胞數(shù)隨小鼠年齡增長而減少： 26周齡小鼠可獲200106個淋巴細(xì)胞。 616周齡小鼠可獲1106個淋巴細(xì)胞。 4個月以上的小鼠可獲0.5106個淋巴細(xì)胞?！痉椒ㄔu價】自動物淋巴器官中分離淋巴細(xì)胞，方法簡便，細(xì)胞收獲量大?？蓮牟煌馨推鞴僦蟹蛛x不同功能的淋巴細(xì)胞或其它免疫細(xì)胞?！九R床意義】由于各種免疫細(xì)胞的分布、分化程度及功能在動物的不同淋巴器官和組織中是不同的，從中制備的細(xì)胞懸液可用于許多不同的免疫學(xué)研究和檢測中，因此這些制備方法在實際工作中被廣泛采用。 【思考題】 1不同動物組織中免疫細(xì)胞的分布有何特點？ 2根據(jù)實驗要求應(yīng)從何種動物組織中分離諸如干細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞更為適宜？四、活細(xì)胞檢測(Viable cell counting)【實驗原理】某些染料能滲入死細(xì)胞內(nèi)使之著色，但不能滲過結(jié)構(gòu)完整的活細(xì)胞膜，從而不被著色。借此在顯微鏡下能鑒別細(xì)胞死活，并計數(shù)細(xì)胞存活率。【試劑和器材】1試劑(1) Hanks液、待檢