1、DNA芯片,DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探針，或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。 由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。DNA芯片又被稱為基因芯片（gene chips）、DNA陣列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array）等。,DNA芯片技術(shù),DNA芯片原理及分類,DNA芯片的操作,DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用與展望,基因芯

2、片的原理是基于核酸分子堿基之間(A-T/C-G互補(bǔ)配對(duì)的原理,利用分子生物學(xué)、基因組學(xué)、信息技術(shù)、微電子、精密機(jī)械和光電子等技術(shù)將基因或DNA分子排列在特定固體物表面構(gòu)成的微點(diǎn)陣。然后將標(biāo)記的樣品分子與微點(diǎn)陣上的DNA雜交,以實(shí)現(xiàn)多達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)分子之間的雜交反應(yīng),高通量大規(guī)模地分析檢測(cè)樣品中多個(gè)基因地表達(dá)狀況或者特定基因(DNA)分子的是否存在的目的 基因芯片的優(yōu)點(diǎn)： 高通量大規(guī)模高度平行性快速高效高靈敏度高度自動(dòng)化 缺點(diǎn)：在同一溫度下雜交，不同探針雜交效率不同。,DNA芯片,制備原理,原理 - 通過(guò)雜交檢測(cè)信息,一組寡核苷酸探針,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,AT

3、ACGTTAGATC,TACGTTAG,由雜交位置確定的一組,核酸探針序列,GTTAGATC,雜交探針組,TATGCAATCTAG,重組的互補(bǔ)序列,靶序列,TACGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,DNA芯片,根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類： 原位合成芯片 synthetic genechips:指采用顯微光蝕刻技術(shù)在芯片的特定部位合成寡核苷酸而制成的芯片。 特點(diǎn)：合成的寡核苷酸鏈較短，密度較高。 DNA 微集陣列 DNA microarry:指將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面。 特點(diǎn)：片

4、段較長(zhǎng)，密度較低。,DNA芯片,DNA芯片的操作及應(yīng)用,DNA芯片,基因芯片使用步驟,芯片制作,把探針固定于載體表面,樣品處理,目標(biāo)分子富集,分子間的雜交,結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析,DNA芯片,基因芯片,熒光標(biāo)記的樣品,共聚焦顯微鏡,獲取熒光圖象,雜交結(jié)果分析,探 針 設(shè) 計(jì),雜交,DNA芯片,芯片的制備包括 支持物的預(yù)處理、 原位合成芯片的準(zhǔn)備 DNA微集陳列的制備,DNA芯片,基因芯片結(jié)構(gòu)示意圖,DNA芯片的制備,支持物分兩類 實(shí)性材料 包括硅芯片，玻璃，瓷片等。目前最常用者為玻璃。預(yù)處理的目的是使其表面形成羥基，氨基等活性基團(tuán)，以便與單核苷酸或DNA形成共價(jià)鍵 膜性材料 包括聚丙烯膜，尼龍膜，

5、硝酸纖維素膜等 通常要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷，以吸附DNA,支持物的預(yù)處理:,DNA芯片,DNA芯片的制備,原位合成芯片的制備,1 顯微光蝕刻技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)：合成速度快，步驟少 缺點(diǎn)：合成的探針短，效率低 2 壓電打印法 合成的探針可達(dá)40-50 nt，合成效率較高,DNA芯片,DNA微陣列的制備,采用事先合成的DNA或制備基因探針，然后打印在支持物上 噴墨打印 優(yōu)點(diǎn)：速度快，量準(zhǔn)，對(duì)支持物表面要求低； 缺點(diǎn)：斑點(diǎn)大，探針密度低，液滴分配不均 針式打印 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，價(jià)低，液滴小，探針密度大； 缺點(diǎn)：準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差,DNA芯片的制備,DNA芯片,噴墨打印技術(shù),DNA芯片,針式打

6、印法（接觸式點(diǎn)樣）,Best!,DNA芯片,點(diǎn)陣的制作,DNA芯片,樣品的準(zhǔn)備包括 樣品的分離純化 擴(kuò)增 標(biāo)記,DNA芯片,分離純化：樣品來(lái)源于活的細(xì)胞，使用一定方法分離并純化DNA或RNA（特別是mRNA）。只有達(dá)到一定純度的樣品，才能保證后續(xù)操作的正確。 目前分離純化使用的試劑均有商品出售，品牌繁多，原理也不盡相同，產(chǎn)物收率和耗時(shí)也相差甚遠(yuǎn),分離純化,DNA芯片,樣品準(zhǔn)備,樣品準(zhǔn)備,樣品的擴(kuò)增：擴(kuò)增的目的在于獲得足夠的樣品量?，F(xiàn)已發(fā)展出固相PCR系統(tǒng)。 樣品的標(biāo)記：主要采用熒光標(biāo)記法，也可用生物素，或放射性核標(biāo)記。標(biāo)記的方式采用PCR或RT-PCR。常用的熒光色素為Cy3、Cy5。用Cy3

7、、Cy5標(biāo)記dNTP，經(jīng)PCR后，產(chǎn)物即可被標(biāo)記。待測(cè)樣品和對(duì)照可采用雙色熒光標(biāo)記。,樣品擴(kuò)增和標(biāo)記,DNA芯片,芯片的雜交： 將已知序列的DNA探針顯微固化于支持物表面，將已標(biāo)記好的樣品與之進(jìn)行雜交，雜交過(guò)程一般在30分鐘完成。樣品與DNA芯片上的探針陣列進(jìn)行雜交。 與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別： 雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成 可同時(shí)平行檢測(cè)許多基因序列 影響雜交反應(yīng)的因素： 鹽濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu),DNA芯片,原理：待測(cè)樣品與支持物上探針列陣雜交后，熒光標(biāo)記的樣品結(jié)合在芯片的特定位置，未結(jié)合的探針被除去； 樣品與探針嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子，熱力學(xué)穩(wěn)定性高，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)，不完全配對(duì)的，

8、熒光信號(hào)弱；不能雜交不產(chǎn)生熒光信號(hào) 分析：采用激光掃描或激光共聚焦顯微鏡采集雜交信號(hào)（位置、強(qiáng)度、顏色），并與對(duì)照比較，經(jīng)相關(guān)軟件進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理。即可得也待測(cè)樣品的信息。 經(jīng)以上獲得的數(shù)據(jù)十分龐大，還需進(jìn)行分析，比較，歸納，才能得出明晰的結(jié)論。,DNA芯片,DNA芯片,基因芯片掃描結(jié)果,不同的顏色代表一個(gè)探針點(diǎn)雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅黃綠蘭紫,DNA芯片,DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用,2,3,1,疾病的診斷與治療,雜交測(cè)序,基因表達(dá)分析,DNA芯片,人類基因組編碼大約30,000個(gè)不同的基因，僅掌握基因序列信息資料，要理解其基因功能是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。 因此，具有監(jiān)測(cè)大量mRNA的實(shí)驗(yàn)工

9、具很重要?；蛐酒夹g(shù)可清楚地直接快速地檢測(cè)出以1:300,000水平出現(xiàn)的mRNA，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)的基因。,DNA芯片,芯片技術(shù)中雜交測(cè)序(sequencing by hybridization，SBH)技術(shù)是一種新的高效快速測(cè)序方法。 用含65,536個(gè)8聚寡核苷酸的微陣列，采用SBH技術(shù)，可測(cè)定200bp長(zhǎng)DNA序列。采用67,108,864個(gè)13聚寡核苷酸的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA測(cè)序。SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。,DNA芯片,基因芯片在感染性疾病、遺傳性疾病和腫

10、瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比： 它可以在一張芯片同時(shí)對(duì)多個(gè)病人進(jìn)行多種疾病的檢測(cè)； 無(wú)需機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能及早診斷，待測(cè)樣品用量??； 能檢測(cè)病原微生物的耐藥性，病原微生物的亞型； 極高的靈敏度和可靠性；檢測(cè)成本低，自動(dòng)化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。 這些特點(diǎn)使得醫(yī)務(wù)人員在短時(shí)間內(nèi)，可以掌握大量的疾病診斷信息，這些信息有助于醫(yī)生在短時(shí)間內(nèi)找到正確的治療措施。,DNA芯片,DNA芯片展望,DNA芯片的出現(xiàn)和應(yīng)用，為DNA測(cè)序，診斷，大面積人群的篩查帶來(lái)了極大的方便，具有通量高，快速，等優(yōu)點(diǎn)。但其不足之處亦是顯而易見(jiàn)的：穩(wěn)定性較低；只能探查已知基因；費(fèi)用過(guò)高及臨床使用的非必須性等因素成為其發(fā)展受到影響。,盡管基因芯片技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注和重視，但在其研究與開(kāi)發(fā)中目前還面臨很多困難