1、1,國外植物藥的研究與開發(fā),第四章 國外植物藥生產中現代科技成果的應用,中藥學院 天然藥物化學教研室,陳麗霞,2,1、植物原料的種植、采摘 2、現代化的制藥技術設備 3、生產過程中的標準化控制,3,1、植物原料的種植、采摘,歐洲藥典、英國藥典、美國藥典國家處方集和日本藥局方均重視對植物藥中的農藥殘留和重金屬限量檢查，美國藥典國家處方集還對植物藥的微生物檢查具有明確規(guī)定。 近年來，中國出口的中藥材、中成藥因鎘、鉛、砷、汞等重金屬和農藥殘留量超標而受阻，使中醫(yī)藥的聲譽受到一定影響。 如何完善中藥質量標準，促使中藥質量標準與國際接軌，走向國際化，是當前中藥國際化面臨的迫切問題。中藥質量標準的國際化將

2、有助于中藥的國際化。,1.1 國外對植物藥原料的標準,4,5,不同國家和地區(qū)使用植物藥的程度不同，對其質量控制的理念也不一致，所制定標準的條目和規(guī)定的檢測限量也各不相同。 不同國家和地區(qū)對食品補充劑或植物藥中的重金屬和農藥殘留的限量標準有較大區(qū)別。,6,如：在重金屬限量標準方面，香港、中國內地、韓國、英國以及世界衛(wèi)生組織均對鉻（Cr）沒有設定限量要求，而美國則對鉻（Cr）設立限量標準。,7,1.2 植物原料的種植采摘,天然藥物涉及到藥材資源問題：人工栽培有利于藥材標準化。 對藥材進行標準化的種植管理，可以提高藥材的產率。 選擇污染較小的栽培基地,減少污染。 選擇地道藥材進行栽培,保證藥材的質量

3、。 科學確定植物的生長時間，植物生長時間不同，有效成分的含量也不同。,8,1.2.1 銀杏的標準化栽培,9,銀杏最早出現于3.45億年前的石炭紀。中生代侏羅紀銀杏曾廣泛分布于北半球，白堊紀晚期開始衰退。 50萬年前，發(fā)生了第四紀冰川運動，銀杏在歐洲、北美和亞洲絕大部分地區(qū)滅絕，只有中國自然條件優(yōu)越，才奇跡般的保存下來。所以，被科學家稱為“活化石”，“植物界的熊貓”。 銀杏大都屬于人工栽培, 在中國、日本、朝鮮、韓國、加拿大、新西蘭、澳大利亞、美國、法國、俄羅斯等國家和地區(qū)均有大量分布。毫無疑問，國外的銀杏都是直接或間接從中國傳入的。,10,銀杏種植標準化：,銀杏的種植方法、苗木的管理、常見病蟲

4、害防治都有標準化的管理，以保證原材料的質量。 例如，銀杏樹主干樹樁4-5年鋸伐一次，鋸伐后從根部分生出幼樹，生長、采摘4-5年，又再次鉅伐（研究證明，4-5年生樹葉有效成分含量最高）。,11,12,1.2.2 銀杏的質量控制 由于銀杏的產地、種植技術和采收期不同對銀杏葉所含成分（內酯和黃酮）也會有較大影響。德國的制藥企業(yè)在投產前首先要對銀杏葉的成分進行分析，以保證原料的內在質量的穩(wěn)定。 銀杏葉有效成分基本上都采用HPLC 測定, 采用山奈素、槲皮素和異鼠李素作為對照品測定銀杏總黃酮的含量; 采用銀杏內酯A、B、C和白果內酯A 為對照品測定銀杏內酯的含量。具體測定方法分述如下：,13,1.2.2

5、 銀杏的質量控制 1.2.2.1 銀杏中黃酮苷含量的測定方法 銀杏葉中總黃酮測定方法是: 銀杏葉黃酮主要成分是黃酮苷形式存在, 經酸水解后生成黃酮醇類化合物, 主要是槲皮素、異鼠李素和山奈素三種組分。用HPLC 分離測定其含量, 再經公式轉換成總黃酮的含量。,14,1.2.2.2 銀杏中萜內酯含量的測定方法 內酯主要以銀杏內酯A、B、C 和白果內酯為主。國外采用一種快速、簡便、準確的測定萜內酯含量的方法，先通過簡便的柱色譜有效地純化樣品, 直接供HPLC 分析，分析圖譜清晰，且干擾峰與待測峰能完全分離。測定結果重現性好, 準確度高。,15,1.2.3 銀杏葉的采摘,應對大規(guī)模的采摘量，主要是采

6、用機械采收。 剛采收的葉子，含水量高，一般達70%左右，如果不及時干燥，容易發(fā)霉變黃，采用大批量快速干燥技術進行干燥。 在種植、采收、干燥加工過程中都實現規(guī)范化，保證原料葉的質量。 科學的確定采摘期也是保證銀杏葉質量的重要因素之一。,16,5-11月各月份生長期的銀杏葉的黃酮苷元：山奈酚、槲皮素、異鼠李素含量。,17,5-11月各月份生長期的銀杏葉的苷元和黃酮苷含量。,18,左： 5-11月各月份生長期的銀杏葉的山奈酚衍生物、槲皮素衍生物含量。,右： 5-11月各月份生長期的銀杏葉的山奈酚苷、異鼠李素苷、槲皮素苷含量,19,5-11月各月份生長期的銀杏葉的雙黃酮含量,Sc-金錢松雙黃酮 Iso

7、g-異銀杏雙黃酮 Gink-銀杏雙黃酮 Bil去甲銀杏雙黃酮 Am穗花杉雙黃酮,20,A：銀杏內酯A，GA B：銀杏內酯B，GB C: 銀杏內酯C，GC D: 白果內酯A，BB,21,22,綜合因素定采摘期： 1、黃酮含量 2、內酯含量 3、葉片大小 （5月份是葉芽，葉的體積最小，黃酮含量高，但收得率低，而且內酯含量也低，內酯是7月份最高。） 4、對植株生長的影響 （7月份采摘對植株的生長會產生不良影響）,23,最終確定采摘期：,一般在七月底八月初，先采摘苗木或幼齡樹的下部葉子，采葉量不可過多，一般不超過苗木的1/3或1/4。八月底九月初采中部葉子，變黃前采上部葉，采葉時，應選擇晴天進行。,2

8、4,1.2.4 日本重視藥材的規(guī)范化種植,日本漢方藥的基礎研究比較細致，藥材從選種、育苗開始有全程質量跟蹤。 日本正在大建中藥材種植基地，從國外引種藥材，現已建成了約3萬平方米的藥材科學專業(yè)種植園。 日本學者采用生物學和遺傳學的手段進行了選拔優(yōu)良品種、育種及栽培移植方面的研究工作。,25,將現代農業(yè)栽培技術應用到藥用植物栽培上，注意使用小型機械精耕細作，盡量不用化肥 和農藥，以保證生藥質量。 日本制訂了藥用植物采集管理規(guī)范（GACP）為獲取優(yōu)質的藥用植物原料，和藥物草本植物制品的生產提供了一般性的技術指南。 培育了黃連、烏藥、日本當歸等約500多個品種，其中栽培基地年產量可達200噸。,26,

9、韓國從公元1567就開始人參的人工栽培。 多年來，韓國一直把高麗參作為拳頭產品，實行原料栽種加工定點生產，種植人參在指定的區(qū)域內并規(guī)定生長年限和采挖年限，有專門技術指導，統(tǒng)一收購后，由政府規(guī)定在唯一的紅參加工廠進行加工再出售。 高麗參與普通作物不同，對土壤的要求非常嚴格，一般情況下收獲過一次人參的土地往往10年內無法再次種植人參。 優(yōu)質的高麗參，其一株，從栽種到消費者購買之前需要長達6年以上的時間和努力。,1.2.5 韓國高麗參的規(guī)范化種植,27,第一步：種植地的選擇。通過土壤分析、現場勘查、耕種人訪談等過程選擇耕地。評價相關土地的土質及土地的方向、坡度、位置等，采集土壤樣本進行農藥及重金屬污

10、染度、土地肥沃度等19個項目的檢查。 第二步：栽培地的管理。相關部門通過定期進行現場耕作情況調查，施行嚴格徹底的栽培狀態(tài)管理。允許使用的農藥種類只有3種，這些農藥也都是具有撒藥3天后自然降解能力的水溶性產品。第三步：收購。6年根高麗參在經兩次農藥檢查合格并獲得適合收購判定后，就會被確定收割日期。,28,2、現代化的制藥技術設備,植物藥（中藥）提取物對生產條件、生產技術要求很高，在西方，很多先進的提取、分離、純化和干燥設備和技術應用于植物藥提取物的生產。 很多設備和技術是隨著植物藥的研發(fā)而應運而生，圍繞著植物藥的生產需求而被打造出來的。,29,2.1 植物藥生產技術： 經典的水-有機溶劑提取法是

11、目前國內外使用的最廣泛的技術。很多先進的提取、分離、純化、干燥設備和技術應用于植物藥提取物的生產中。,30,（一）常溫超高壓技術,高壓生物化學研究已經證明：壓力達到一定值，蛋白質、多糖（淀粉、纖維素）等有機大分子會發(fā)生變性，但生物堿、低聚糖、甾、萜、苷、揮發(fā)油、維生素等小分子物質則不發(fā)生任何變化。 超高壓提取就是利用了超高壓對生物材料的這種作用實現有效成分提取的。植物細胞壁上有很多微孔，因此我們可以把植物細胞壁看作是由許多微孔組成的薄膜。當植物細胞處于溶劑中時，溶劑將通過這些微孔進入細胞內部。 常溫超高壓提取技術可以使用多種溶劑，包括水、不同濃度的醇和其它有機溶劑，可以從不同的天然產物中提取不

12、同性質（如生物堿、黃酮、皂甙、多糖、揮發(fā)油）的有效成分。,31,（二）超聲波提取技術,超聲波是一種高頻率的機械波。超聲場主要通過超聲空化向體系提供能量。頻率范圍在15-60kHz的超聲，常被用于過程強化和引發(fā)化學反應，超聲波在天然產物有效成分提取等方面已有了一定作用。其原理主要是利用超聲的空化作用對細胞膜的破壞，有助于有效成分的溶出與釋放，超聲波使提取液不斷震蕩，有助于溶質擴散，同時超聲波的熱效應使水溫基本在57，對原料有水浴作用。超聲波提取與傳統(tǒng)的回流提取、索氏提取法比較，具有提取速度快、時間短、收率高、無需加熱等優(yōu)點。已被許多天然產物分析過程選為供試樣處理的手段。,32,（三）微波輔助提取

13、技術,微波是一種非電離的電磁輻射。微波輔助提取（Microwave Assisted Extraction，MAE）是利用微波能來提高萃取率的新發(fā)展起來的技術。微波輻射誘導萃取技術具有選擇性高、操作時間短、溶劑耗量少、有效成分收率高的特點，已被成功應用在藥材的浸出、中藥活性成分的提取方面。它的原理是利用磁控管所產生的每秒24.5億次超高頻率的快速震動，使藥材內分子間相互碰撞、擠壓，這樣有利于有效成分的浸出，提取過程中，藥材不凝聚，不糊化，克服了熱水提取易凝聚、易糊化的缺點。 微波萃取技術有一定的局限性，只適宜于對熱穩(wěn)定的產物。,33,（四）超臨界流體萃取技術,超臨界流體萃?。⊿upercrit

14、ical Fluid Extraction，SFE）技術是20世紀60年代興起的一種新型分離技術。20世紀80年代，由于其選擇分離效果好、提取率高、產物沒有有機溶劑殘留、有利于熱敏性物質和易氧化物質的萃取等特點SFE技術逐漸被運用到天然產物有效成分的提取分離上，并且與GC、IR、GC-MS、HPLC等聯用形成有效的分離技術。 超臨界流體（SF）是指在臨界溫度和臨界壓力以上，以流體形式存在的物質，目前研究較多、最常用的超臨界流體是二氧化碳。在超臨界狀態(tài)下將SF與待分離的物質接觸，使其有選擇性地溶解其中的某些組分。SF的密度和介電常數隨著密閉體系壓力的增加而增加，因此利用程序升壓可將不同極性的成分

15、進行分步提取。,34,（五）大孔樹脂吸附,大孔吸附樹脂是一類新型高分子分離材料，是一種高聚物吸附劑，根據其孔徑、比表面積及構成類型分為許多型號。20世紀70年代開始用來進行天然產物有效成分的分離純化研究。 大孔吸附樹脂分離技術的應用原理主要是利用大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結合的原理，從天然產物提取液中有選擇的吸附其中的有效成分，去除雜質。采用大孔吸附樹脂分離純化操作的基本程序大多是：天然產物提取液通過大孔樹脂吸附有效成分乙醇溶液梯度洗脫回收溶劑得到提取液浸膏干燥半成品。 大孔吸附樹脂工藝對于富集天然產物中的黃酮類、生物堿類、苷類等有效成分是卓有成效的。,35,（六）膜分離技術,膜分離技術是

16、一項新興的高效分離技術，已被國際公認為是20世紀末到21世紀中期最有發(fā)展前途的一項重大高新生產技術。是利用天然或人工合成的具有選擇透過性的薄膜，以外界能量或化學位差為推動力，對雙組分或多組分體系進行分離、分級、提純或富集的技術。膜分離技術包括超濾、微濾、納濾和反滲透等。 膜分離技術的應用原理近似機械篩，是以壓力為推動力，實現溶質與溶劑的分離，溶劑（水）和其它小分子量溶質透過具有不對稱微孔結構的濾膜，大分子溶質和微粒（如蛋白質、病毒、細菌、膠體等）被濾膜阻留，從而達到分離、提純和濃縮產品的目的。在常溫下操作，無相變，能耗低。 采用超濾技術可以濾除天然產物水提液中的相對分子量大于幾萬的雜質（無效成

17、分），如纖維素、黏液質、樹膠、果膠、淀粉、鞣質、蛋白質（少數藥材除外）、樹脂等成分。,36,（七）分子印跡技術,分子印跡技術（MIT）是20世紀末出現的一種高選擇性分離技術，這種技術是選用能與印跡分子產生特定相互作用的功能性單體，在印跡分子周圍與交聯劑進行聚合，形成三位交聯的聚合物網絡，然后，通過合適的溶劑除去印跡分子，在聚合物網絡中形成空間和化學功能與印跡分子互補的空穴。整個聚合過程可分為三步：印跡、聚合、去除印跡分子。 例如,在極性溶劑中以丙烯酰胺作為功能單體，以強極性化合物槲皮素為印跡分子，制備了分子印跡聚合物（MIP）。液相色譜實驗表明。MIP對槲皮素具有特異的親和性。將此MIP直接分

18、離銀杏葉提取物水解液，得到主要含槲皮素及與槲皮素結構相似化合物山奈酚兩種黃酮的組分。研究證實了MIP用于直接分離、提取植物藥中具有特定藥效化合物的可行性。,37,2.1.1 德國EGb761生產工藝,EBG761與其他廠家生產的銀杏葉提取物的區(qū)別在于其特定的工藝和標準。 其工藝是以丙酮-水為起始溶劑進行粗提取，再經過脫脂除去銀杏酸、原花青素等脂溶性成分，富集二萜內酯和黃酮類成分，經過27道工序制成提取物。 總黃酮苷為22%-27%，總內酯5%-7%，銀杏酸類成分5ug/g以下。,38,銀杏內酯與銀杏酸在葉中的含量是相近的，提取工藝科高度富集內酯，最大限度分離除去銀杏酸。 丙酮-水提取工藝也需脫

19、脂，主要是除去脂溶性的銀杏酸，其脫脂工藝是三氯甲烷萃取，有污染，但在全封閉的生產線上，污染控制得很好。 確定丙酮-水提取工藝的重要原因：是其可以較好的提取黃酮苷及萜類成分，而乙醇-水系統(tǒng)卻較容易將致敏物質烷基酚類（銀杏酸類）成分提取出來。,工藝分析：,39,EGb761所含成分的組成,EGb761 的成分經多年的數據積累（30年不罷休的研究），得到的大致比例。 植物藥的特點就是，不同工藝生產的提取物所含成分很難一致，已知的一致，未知的也不一致。 療效的發(fā)揮取決于其中的成分，成份的組成取決于提取的工藝，對于植物藥，一個工藝代表一個藥品。（工藝是藥品的代名詞）,40,EGb761提取工藝也存在滯后問題,生產EGb761的工藝是德國Schwabe 的專利工藝，而這一專利工藝限于上世紀70年代初的技術水平，生產工藝不盡合理（三氯甲烷萃取除銀杏酸）。 但要改變生產方法則又需經過一系列科研和藥政手續(xù)，要進行全套研究工作，實非易事。,41,2.1.2 日本先進的漢方藥制劑生產技術： 日本把低溫提取、真空濃縮、冷凍干燥、軟水抽提、真空沸騰造粒等現代制藥的最新技術應用于漢方藥的研究中，大大提高了產品的質量。盡量保持了原有處方煎劑的性質，減少了有效成分的損失，實現了科學化的生產管理。 整個生產的過程參照漢方GMP規(guī)定，整個生產過程采用先進的工藝