1、引物純化方式選擇指南2012-2-16 10:24:14內(nèi)容導(dǎo)讀一、DNA合成的方法和原理二、引物純化的方法原理及其效果三、純化方法與應(yīng)用指南四、常見問題的原因分析及相應(yīng)的對策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亞磷酰胺三酯法進(jìn)行?；谠摲椒ǖ腄NA合成儀有多種，由ABI/PE公司生產(chǎn)的高通量DNA自動合成儀得到了廣泛的應(yīng)用。各合成儀進(jìn)行引物合成的原理基本相同，主要區(qū)別在于合成產(chǎn)率的高低、試劑消耗量和單個循環(huán)用時等。生工公司采用的合成儀主要機(jī)型為全新的ABI3900高通量合成儀。固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn)。該方法是在固相載體上

2、完成DNA鏈的合成的，DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成過程從5 3方向延伸，而是由3端開始，相鄰的核苷酸通過3 5磷酸二酯鍵連接。具體的反應(yīng)步驟如圖一。1、脫保護(hù)基 (Deblocking) 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脫去連結(jié)在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)DMT (二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。2、活化 (Activation) 將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體 (其3-端已被活化，但5-端仍受DMT保護(hù))，此中間體將與

3、GPG上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。3、連接 (Coupling) 亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護(hù)基的核苷酸時，將與其5-羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。4、封閉 (Capping) 縮合反應(yīng)后，為了防止連在CPG上的未參與反應(yīng)的5-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙?；瘉矸忾]此端羥基，一般乙?；噭┦怯靡宜狒蚇-甲基咪唑等混合形成的。圖1: DNA合成原理示意圖（固相亞磷酰胺三酯法）5、氧化 (Oxidation) 縮合反應(yīng)時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時常用碘的四氫

4、呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。經(jīng)過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT后，重復(fù)以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到DNA片段粗品。最后對其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基，合成的Oligo在脫去保護(hù)基后，目的Oligo純度是比較低的，其中含有大量的雜質(zhì)。主要雜質(zhì)有：所脫下的保護(hù)基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時產(chǎn)生的短鏈等。以至于粗產(chǎn)品中全長Oligo DNA含量僅為25%左右。盡管合成時每一步的效率都在98%99%，但累積的效率并不高。這些雜質(zhì)成分，尤其是存在于粗產(chǎn)品

5、中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準(zhǔn)，還會影響下一步的反應(yīng)。因此必須對Oligo DNA進(jìn)行純化、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。二、引物純化的方法原理及其效果基于以上合成的原理和步驟，目前，常見的幾種純化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、HPLC。生工公司采用HAP、ULTRA PAGE、HPLC三種純化方法，其純化的原理及其效果分別如下，我們建議客戶應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適、經(jīng)濟(jì)并有效的純化方法。1. HAP純化方法HAP（HighAffinityPurification）是生工生物自主開發(fā)的新型oligoDNA純化方法。該方法已取得國家專利（專利號：0.X

6、）。其原理是利用合成引物5-端DMT基團(tuán)對HAP樹脂專一性吸附，而不含DMT的短鏈DNA不被吸附，從而達(dá)到分離純化的目的。HAP純化柱中裝有對 DMT 具有親和力的樹脂，合成DNA 片段時保留 5端最后一個堿基上的 DMT，所有合成產(chǎn)物吸附在柱上以后，用稀的有機(jī)溶劑洗柱，帶有 DMT 的片段吸附能力強(qiáng)，不易被洗脫，不帶有 DMT 的片段吸附能力弱，被洗脫。然后用三氟乙酸 TFA 或三氯乙酸 TCA 脫去 DMT 基團(tuán)，再用濃一點(diǎn)的有機(jī)溶劑洗脫 DNA。這種方法具有多快好省的特點(diǎn)。制品純度可達(dá)到8090%，可以滿足雜交探針、測序、常規(guī)PCR（不再做進(jìn)一步克隆實(shí)驗(yàn)）等用途了。但是因?yàn)槠鋵Ｒ恍晕?

7、DMT 能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負(fù)載量小。特別是對長于39 堿基以上的片段純化效果不好。此級別只提供長度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品。序列更長時，制品的純度得不到保證。若考慮節(jié)約經(jīng)費(fèi)，對于要求較低的實(shí)驗(yàn)，如簡單的PCR反應(yīng)，則采用HAP純化即可。2. ULTRA PAGE純化方法PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)，該方法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化基于尺寸和構(gòu)象分離全長產(chǎn)物和失敗序列，可以分離相差一個堿基的引物(120堿基以內(nèi))，從而提供

8、高純度的引物。純化后的DNA純度大于90%，相比與其他兩種方法，PAGE純化對長鏈Oligo DNA (大于50 mer)的純化特別有效，制品純度保證90 95%。如訂購的DNA欲用作RT-PCR引物、各種探針，或用于PCR克隆測序、定點(diǎn)突變等，請選用PAGE純化制品。ULTRA PAGE：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。經(jīng)過PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，上樣量都是非常大，電泳時的條帶往往比較寬，帶與帶之間有重疊，分辨率有所下降，電泳后割帶回收目的引物時，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬，很難避免割到差別僅一個或幾個堿基的引物。因此生工生物為了給客戶更

9、好解決以上問題，將原有的PAGE純化方式升級優(yōu)化為現(xiàn)在的ULTRA PAGE純化方式，即在PAGE純化的同時配合質(zhì)譜對DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。3. HPLC純化方法HPLC (High Performance Liquid Chromatography)是使用高效液相色譜的原理，依據(jù)DNA的疏水性來分離產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同長度的 DNA 片段的疏水性不同，一般來說較長的片段具有較強(qiáng)的疏水性，AT含量高的片段也具有較強(qiáng)的疏水性。先將粗產(chǎn)物檢測主峰位置，再增加加樣量，回收主峰位置的部分。該方法用于分離純化時能達(dá)到很高的純度和靈敏度，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除

10、去失敗序列或未結(jié)合的標(biāo)記物，從而對DNA片段進(jìn)行純化。同時配合質(zhì)譜對DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。由于HPLC產(chǎn)品的純度非常高，使用本法純化的DNA制品可適用于各種基因工程實(shí)驗(yàn)。主要用于PCR克隆、定點(diǎn)突變、人工合成基因、長鏈和修飾引物的純化等。它的優(yōu)點(diǎn)是自動化程度高、省人力；弱點(diǎn)是純化量通量小、成本較高。三、純化方法與應(yīng)用指南表1: HAP、ULTRA PAGE和HPLC三種純化方法的特點(diǎn)比較純化方式純化原理優(yōu)缺點(diǎn)應(yīng)用HAP采用純化柱上特異性樹脂對DNA 片段上保留 5端最后一個堿基上的 DMT有親和吸附作用從而達(dá)到分離純化。多快好省的特點(diǎn)。純度可達(dá)到8090%，但是對長于40

11、堿基以上的片段純化效果不好?？梢詽M足雜交探針、測序、常規(guī)PCR（不再做進(jìn)一步克隆實(shí)驗(yàn)）等用途。ULTRA PAGE采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，基于凝膠的尺寸和DNA的構(gòu)象原理，可以分離相差一個堿基的引物，從而達(dá)到對全長產(chǎn)物和失敗序列進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA，同時配合質(zhì)譜對DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。純度好，準(zhǔn)確性高，對于較長序列（40-120），制品純度保證9095%，相比與其他兩種方法，ULTRA PAGE純化對長鏈引物(大于50mer) 的純化特別有效，缺點(diǎn)需要跑電泳并切膠回收，費(fèi)時費(fèi)力?？蛇m于多重PCR、亞克隆、點(diǎn)突變、各種探針，或用于PCR克隆測序、定點(diǎn)突變

12、等。HPLC采用高效液相色譜的原理，依據(jù)DNA的疏水性來分離產(chǎn)物的。合成粗產(chǎn)物中不同長度的 DNA 片段的疏水性不同，一般來說較長的片段具有較強(qiáng)的疏水性，同時配合質(zhì)譜對DNA進(jìn)行定性分析，以保證回收片段的正確性。該法自動化程度高、省人力；對于較長片段(大于89 mer)，純化效果不如ULTRA PAGE方法好。盡管對于較長序列，但如果實(shí)驗(yàn)對制品的純度要求非常高， HPLC與ULTRA PAGE雙重精制會使效果更佳，其弱點(diǎn)是純化通量小、成本較高。因其HPLC產(chǎn)品的純度非常高，使用本法純化的DNA制品可適用于各種基因工程實(shí)驗(yàn)。主要用于PCR克隆、定點(diǎn)突變、人工合成基因、長鏈和修飾引物的純化。對40

13、 mer以下的DNA制品， HPLC是最好的純化方法，其次是ULTRA PAGE； 而對40 mer以上的DNA制品ULTRA PAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對PCR產(chǎn)物克隆后測序，一定要選擇ULTRA PAGE純化或HPLC純化的引物。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，您可以選用以下適合的純化方法，具體見表2。表2: HAP、ULTRA PAGE和HPLC三種純化方法的應(yīng)用應(yīng)用引物長度要求純化方法要求普通PCR/RT-PCR40baseULTRA PAGE多重PCR/定量PCR根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC測序根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP診斷PCR擴(kuò)增根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP, U

14、LTRA PAGE亞克隆，點(diǎn)突變根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC基因構(gòu)建根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC全基因合成根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HAP反義核酸根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HPLC修飾/標(biāo)記引物根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定HPLCPCR產(chǎn)物用于克隆表達(dá)研究或基因重組等根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求定ULTRA PAGE, HPLC四、常見問題的原因分析及相應(yīng)的對策Q-1. 拿到引物后，想在實(shí)驗(yàn)室檢測純度，如何實(shí)現(xiàn)？A-1:實(shí)驗(yàn)室可通過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行引物純度的檢測：使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，堿基數(shù)12個的引物用20%的膠，12-60個堿基的引物用16%的膠，60個堿基的引物用12%的膠

15、。取0.2-0.5 OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95，2 min）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時間后（約2-3小時），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。（有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，是引物二級結(jié)構(gòu)條帶）Q-2. 測序發(fā)現(xiàn)引物有突變或缺失是什么原因？A-2:測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)有突變，主要考慮三個方面的原因：測序，PCR/克隆過程，引物本身。A、測序引入的錯誤對于PCR產(chǎn)物進(jìn)行的克隆而言，無論是TA克隆或酶切克隆，引物區(qū)往往位于載體兩端，如果用載

16、體引物進(jìn)行測序，此時克隆引物區(qū)離測序引物區(qū)的距離比較近，處于測序起始階段或正好處于測序染料峰所在的區(qū)域內(nèi)（90-120 bp），這兩個區(qū)域也是最容易產(chǎn)生測序錯誤的地方。因此，首先要看原始的測序峰圖在引物區(qū)內(nèi)是否清晰，堿基的錯誤或缺失是否是由于峰圖不清楚而導(dǎo)致的計(jì)算機(jī)誤讀。B、PCR/克隆過程盡管使用高保真聚合酶進(jìn)行PCR出錯的可能性比較少，但不排除PCR錯配或者克隆過程中突變的可能。有的人會問，PCR的突變怎么會出現(xiàn)在引物區(qū)呢？這是因?yàn)?，引物是單鏈，PCR產(chǎn)物引物區(qū)的互補(bǔ)鏈同樣是以引物為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的，因此，有可能存在引物正確但其產(chǎn)物出錯的情況。針對這種情況的解決方法是進(jìn)行測序時，請送2-

17、3個獨(dú)立的克隆子進(jìn)行測序，這樣可以排除PCR過程出錯或克隆產(chǎn)生突變的情況。C、引物本身錯誤如前面所述，引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，即使每一步合成效率達(dá)到99%，仍有1%的序列不能連接或錯誤地連接下一個堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；對于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于實(shí)驗(yàn)中測序發(fā)現(xiàn)的較常見堿基缺失的可能原因如下：1. 由于DNA合成是沿著35端方向?qū)A基逐個連接上去的，每連上一 個堿基，都需要經(jīng)過 (Detr

18、itylation、Coupling、Capping、Oxidation)一個循環(huán)。Coupling是上一個堿基的5-OH 與下一個堿基的3活性部分發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)的效率最高可達(dá)99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；2. Capping是將沒有連接上下一個堿基的5-OH乙酰化，Capping的效率不可能達(dá)到100%，沒有被乙?；?OH會進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，造成中間缺堿基的失敗序列；3. Detritylation是脫掉上一個堿基5-OH上的保護(hù)基，準(zhǔn)備連接下一個新堿基，Detritylation的效率也不可能達(dá)到100%

19、，沒有脫保護(hù)的5-OH會跳過該循環(huán)而直接進(jìn)入下一個循環(huán)，造成中間缺堿基的失敗序列； 至于插入突變，引物序列中往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分堿基發(fā)生丟失DMT，處于活性狀態(tài)的新堿基在沒有與上一個堿基反應(yīng)前發(fā)生自連，將會造成堿基重復(fù)，故會發(fā)生插入同一堿基的突變的失敗序列。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，通常發(fā)生在G轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體2,6-diaminopurine（脫嘌呤），DNA復(fù)制和PCR過程中DNA聚合酶將2,6-diaminopurine看作堿基A，發(fā)生G到A的轉(zhuǎn)換，測

20、序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。引物合成過程中，造成堿基缺失，插入，置換突變的因素客觀存在，上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。但是基于目前大規(guī)模生產(chǎn)的純化方法，還不能達(dá)到100%的純度，對40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的純化方法，其次是ULTRA PAGE；而對40 mer以上的DNA制品ULTRAPAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對PCR產(chǎn)物克隆后測序，一定要選擇ULTRA PAGE純化或HPLC純化的引物。測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是偶爾也會發(fā)生?？蛻粢话?/p>

21、可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列復(fù)制到合成儀的，人為造成的序列出錯可能微乎其微。在目前的技術(shù)水平下，各家公司還沒有辦法徹底解決引物合成出錯的這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所以每個合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有哪家公司可以完全避免。Q-3. 長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？A-3:引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，出錯的頻率累加起來就越高?？蛻艨傁Ｍ铣傻囊锿耆_，這種心情可以理解。但是正像PCR擴(kuò)增，不可能絕對保證

22、擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。通常引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，特別是長鏈引物合成，出了建議選擇ULTRA PAGE和HPLC聯(lián)合使用的純化方法，同時您也要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。Q-4. 如何能保證引物的正確性?A-4:1. 訂購引物時，選用高純度級純化方法。2. 最好選用小于40個堿基的引物。 3. 克隆實(shí)驗(yàn)時，一定要選擇ULTRA PAGE純化或HPLC純化的引物。并且每次克隆都須進(jìn)行測序驗(yàn)證，以保證序列的正確性，然后再進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)時，尤其需要注意。Q-5. PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯誤， 怎么辦?A-5:1. 遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數(shù)據(jù)。2. 如果確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。因?yàn)橐锛兌炔豢赡苁?00%，因此，挑