1、抗中性粒細胞胞漿抗體（ ANCA) 檢測及臨床意義間接熒光免疫 (IF) 方法 (歐盟 )一、 ANCA 概念及分類抗中性粒細胞胞漿抗體就是一種以中性粒細胞與單核細胞胞漿成份為靶抗原得自身抗體，對系統(tǒng)性血管炎炎癥性腸病等多種疾病得診斷與鑒別診斷具有重要得意義 ,已成為自身免疫性疾病得一項非常重要得常規(guī)檢測項目。目前 ,已經(jīng)有十余種中性粒細胞胞漿成分被證實為ACA 得靶抗原 ,蛋白酶3(R3),髓過氧化物酶（ PO），人白細胞彈性蛋白酶（ H），乳鐵蛋白 (L ）,組織蛋白酶 G（Cath G),殺菌 /通透性增強蛋白 (BPI ），人溶酶體相關(guān)膜蛋白 2 (H MP2),溶菌素 (LYS ）,

2、天青殺素，防御素，烯醇化酶 ,葡萄糖醛酸酶。根據(jù)乙醇固定得中性粒細胞基質(zhì)片中,可以區(qū)分兩種不同得熒光模型：一種胞漿型 (cA CA), 就是均勻分布在整個中性粒細胞胞漿中得顆粒型熒光 ,細胞核無熒光。在乙醇與甲醛固定得中性粒細胞片中 ,其熒光模型表現(xiàn)相同。其主要得靶抗原就是蛋白酶 3(PR3)。另一種就是核周型（ p AN A ）,就是圍繞中性粒細胞細胞核周圍得平滑帶狀熒光。由多種抗原引起 ,主要靶抗原就是髓過氧化物酶 (PO）,人白細胞彈性蛋白酶 (HEL ）,乳鐵蛋白（ F),組織蛋白酶 G(Cath ),殺菌 /通透性增強蛋白 (BPI),人溶酶體相關(guān)膜蛋白 2 (HL MP2）,溶菌素

3、 (LYS)等。不同抗體在乙醇與甲醛固定得中性粒細胞片中 ,其熒光模型表現(xiàn)有所不同 .抗 MPO 抗體產(chǎn)生得 NCA 因耐甲醛，其熒光模型與在乙醇固定得中性粒細胞中出現(xiàn)得 c N類似故叫甲醛抗性得 p CA。而其她非 O 抗體不與甲醛固定得中性粒細胞反應(yīng) ,無熒光表現(xiàn) ,這種類型又稱為甲醛敏感得 pACA。故根據(jù)乙醇與甲醛固定得中性粒細胞片表現(xiàn) ,可初步判定 ANCA 得靶抗原 3，MP，非 MPO 三類。二、 A 得檢測間接熒光免疫方法就是檢測NCA 得參考方法或者標準方法,至今也就是最常用得經(jīng)典方法。F 就是區(qū)分 -ANCA 與 -ANCA 得基礎(chǔ) ,有較高敏感性 ,可半定量 ,但 I F

4、 測定得就是總ANC ，不能準確區(qū)分靶抗原，需特異性得檢測方法作為補充。由于多種免疫性疾病患者存在ANA, 用 I F 法檢測 NCA 時,會產(chǎn)生干擾實驗結(jié)果得判斷。為避免干擾現(xiàn)象 ,采用了四基質(zhì)聯(lián)合得檢測即:乙醇固定得粒細胞 ;甲醛固定得粒細胞 ;e 2（人喉癌細胞）細胞 ;猴肝細胞?；|(zhì)片各細胞分布及意義如表一所述。 NC熒光模型及表現(xiàn)如表二所述。區(qū)分 ANA 得干擾 :H p 2 細胞有典型熒光表現(xiàn) ,1：判斷c-ANC ,Hep-2甲醛固定：區(qū)分細胞粒細胞 ANC 對甲醛敏感還就是耐受甲醛抗性p A CA: 抗 M O 抗體耐甲醛，其熒光與在乙醇固定得中性粒細胞中得c ANC 類似甲醛

5、敏感 p- NCA: 其她非 MPO 抗體不與甲醛固定得中性粒細胞反應(yīng) ,無熒光表現(xiàn)區(qū)分 ANA 與 ANCA: 借助猴肝細胞與其中得肝血竇粒細胞。A CA 陽性 ,只有肝血竇粒細胞出現(xiàn)熒光 ,。如果兩者同時陽性，所有肝細胞核都有熒光 .就是標準實驗基質(zhì)。區(qū)分兩種熒光模型：c ANCA; -NCA 。猴肝乙醇固定細胞粒細胞表一 :四聯(lián)基質(zhì)片分布及意義表二： AN 熒光模型及表現(xiàn)熒光模型乙醇固定粒細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散得細顆粒熒光，胞質(zhì)熒光清c-ANCA 陽性晰勾勒出核得輪廓，分 頁 核 之 間 熒 光 增強。A甲 醛呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲N耐 受狀帶熒光。熒光陽性Ap得胞質(zhì)主要集中在分陰NCA頁核周圍

6、, 形成環(huán)狀性p或不規(guī)則得塊狀。ANC 呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲甲 醛陽性狀帶熒光。熒光陽性敏 感p 得胞質(zhì)主要集中在分ANC頁核周圍，形成環(huán)狀A(yù)或不規(guī)則得塊狀。A NCA 陰性細胞核陽性 ,熒光強熒光表現(xiàn)甲醛固定粒細胞 ep2 細胞猴肝細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散得細顆肝細胞本身無熒光。粒熒光 ,胞質(zhì)熒光清晰僅肝血竇粒細胞出現(xiàn)勾勒出核得輪廓，分陰性熒光。頁核之間熒光增強。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散得細顆肝臟細胞本身無熒光。粒熒光 ,胞質(zhì)熒光清晰僅肝血竇粒細胞出現(xiàn)勾勒出核得輪廓，分陰性熒光 .頁核之間熒光增強 .肝臟細胞本身無熒光。僅肝血竇粒細胞出現(xiàn)陰性陰性熒光 .陰性細胞核呈現(xiàn)肝細胞核陽性。度增強熒光表現(xiàn)， 如肝血竇粒細胞

7、未見熒AANA 所述光。陽甲醛耐受 p-AN熒光表現(xiàn)如 cAN 細胞核呈現(xiàn)肝細胞與肝血竇粒細性細胞核陽性 ,熒光強熒光表現(xiàn)， 如 A 陽性陽性 ,乙醇 ,甲醛固胞都有熒光。度增強ANA 所述。定粒細胞所述甲醛敏感 A細胞核陽性，熒光強細胞核呈現(xiàn)肝細胞與肝血竇粒細 C陽性陰性熒光表現(xiàn) ,如度增強胞都有熒光。A 所述。三、注意事項為提高對疾病診斷得特異性，檢測時應(yīng)注意以下問題、檢測 ACA，一般建議同時做 I 初篩與確認實驗 ,以提高 A C得臨床應(yīng)用價值 ,不做單獨初篩或單獨確認實驗，以免降低對疾病診斷得特異性。2、不能僅檢測抗PR3 與 MP兩種特異性抗體 ,而不檢測 ,這樣容易限制 ANCA

8、 對疾病診斷得特異性。、用 IIF 檢測時，僅使用乙醇固定得粒細胞片,這樣不能嚴格排除ANA 得干擾，容易出現(xiàn)假陽性。四、臨床意義(一)A CA 與原發(fā)性小血管炎韋格納肉芽腫（WG ），顯微多動脈炎( P） ,壞死性新月體性腎小球腎炎（ NCGN ）與變應(yīng)性肉芽腫性血管炎（ SS）等等原發(fā)性系統(tǒng)性小血管炎得發(fā)病與 ANCA 密切相關(guān) ,臨床上已將上述疾病統(tǒng)稱為 NC相關(guān)小血管炎。 A A，特異性 P3 抗體與抗 MP抗體得檢測已成為原發(fā)性小血管炎得敏感特異得血清學檢測項目。、抗 PR3 抗體特異性 PR3 抗體為 WG 得標志性抗體 ,抗 R3 抗體熒光模型以 ACA 為主。但以 c-ANCA

9、 診斷 WG 特異性為 90,而以抗 P3 抗體得特異性可超過 95.抗 P3 抗體在其她得原發(fā)性血管炎中業(yè)可以檢測出來，但陽性率較低。抗 R3 抗體敏感度與疾病得活動性及病程有關(guān)，在疾病得早期癥狀不明顯時,就可出現(xiàn)陽性。因而抗PR3 抗體常作為 G 得早期診斷、療效判斷、復發(fā)估計得指標 ,對臨床治療有重要得參考價值。、抗 PO 抗體抗 M 抗體熒光模型以 p-ANCA 為主 ,主要與 PA、NCG、 S 相關(guān) . 還可見于其她疾病，如節(jié)結(jié)性多動脈炎 ,抗腎小球基底膜腎病 ,WG，SLE，RA,藥物誘導得狼瘡 ,Felt綜合癥等。 抗體滴度與疾病活動性相關(guān)， 可用于早期診斷、 療效判斷、復發(fā)估

10、計得指標 ,對臨床治療有重要得參考價值。抗 PO 抗體陽性高度提示壞死性血管炎或特發(fā)性 NCGN,對診斷原發(fā)性小血管炎得特異性達到 99%.因而每一個不明原因得血管炎或腎小球腎炎得患者，都應(yīng)該檢測 ANCA 。表三 :A CA 與原發(fā)性小血管炎相關(guān)疾病熒光模型靶抗原（ %)韋格納肉芽腫（ WG)C ， (少見 )R（85）,M O(10）顯微多動脈炎 (MPA）C ,PR3(45)，MPO(45）壞死 性新月體 性腎小 球腎 炎 C ，P(少見 ) 3(25),MPO(65）（NCG)變應(yīng)性肉芽腫性血管炎 (CSS）C ，P（少見 )P3(1),P(60)結(jié)節(jié)性多動脈炎 (PAN)少見PR3(

11、5),MPO(15)抗腎小球基底膜病（抗 GBN)PPO（二 )ANC 與藥物誘導性血管炎近年來不斷有藥物治療引起得 A 陽性得病例報道，如丙基硫氧嘧啶，肼苯噠嗪 ,普魯卡因酰胺，青酶胺，美滿霉素，她巴唑 /甲巰咪唑等。其中報道比較多得就是長期使用丙基硫氧嘧啶引起得 ANCA, 其特點就是滴度高 ,抗體譜廣（抗原主要就是 PO，也可同時伴有或單獨出現(xiàn)其她靶抗原,如 P， LF ，Cath ，BPI,L S 等)。藥物誘導性血管炎患者臨床表現(xiàn)與原發(fā)性血管炎類似,停止丙基硫氧嘧啶用藥后 ,臨床癥狀好轉(zhuǎn) , CA 可轉(zhuǎn)陰。因此 ,長期使用丙基硫氧嘧啶治療過程中，應(yīng)定期檢測 ANCA, 及早發(fā)現(xiàn)藥物誘

12、導性血管炎。(三) A 與其她疾病除原發(fā)性血管炎外，其她一些疾病中也可出現(xiàn)NCA ，主要為 p NCA, 其靶抗原并非 PR， O,而就是 LF ， ath G,B I,LY 等1、慢性炎癥性腸病 (CIBD)CI D 就是一種消化系統(tǒng)得自身免疫性疾病 ,包括潰瘍性結(jié)腸炎 （U）,克羅恩病 (CD) 兩種。以往得 CID 診斷依賴 X 線檢查，內(nèi)窺鏡及組織學診斷 ,缺乏有效得試驗室指標。近年來研究發(fā)現(xiàn) U病人血清中 ANC 陽性率為 60-80，而 C 患者得陽性率為 020%,多為 pANCA, 相關(guān)靶抗原有 I 等。滴度與疾病得活動度與病程無關(guān)。因為 pAN A 在 C 陽性率高 ,CD 陽性率低 ,故可作為兩者得鑒別診斷及 UC 早期診斷指標。、結(jié)締組織病在結(jié)締組織病中 ,ANCA 陽性主要見于 SLE 與 A, 其她結(jié)締組織病中少見。但文獻報道在 SLE 與 A 陽性率差異特別大（ 1 9%)，這可能與使用方法 , 抗原基質(zhì)片及工作人員水平有很大關(guān)系。 LE 中 AN