1、,專(zhuān)題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),課題3 血紅蛋白的提取和分離,一、基礎(chǔ)知識(shí),1.蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù),蛋白質(zhì)的各種差異,1.分子的形狀、大小 2.電荷性質(zhì)和多少 3.溶解度 4.吸附性質(zhì) 5.對(duì)其他分子親和力,2.方法及原理,1.概念：根據(jù)被分離物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離。,性質(zhì)：微小的多孔球體 本質(zhì)：多糖類(lèi)化合物 實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖,2.原理：當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，

2、移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。(相對(duì)分子質(zhì)量大的先被洗脫出來(lái)）,緩沖溶液,1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的溶液。 2、作用：能夠抵制外界的酸或堿的對(duì)溶液的pH的影響，維持pH基本不變。 3、配制：通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,（1）還記得人體血液中的緩沖液?jiǎn)幔?H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4,（2）你認(rèn)為在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么？目的是什么？,本實(shí)驗(yàn)使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)

3、境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀(guān)察（紅色）和科學(xué)研究（活性）。,1、概念：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 2、原理： 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,3、類(lèi)型： 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。 在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常用SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳 應(yīng)用：測(cè)定蛋白質(zhì)分子量、進(jìn)行蛋白質(zhì)純度鑒定 原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯

4、酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS：消除凈電荷對(duì)遷移率的影響。,二、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)步驟,血紅蛋白的組成, ,血紅素基因,可攜帶一分子O2或一分子CO2,1. 紅細(xì)胞的洗滌,閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？ 洗滌干凈的標(biāo)志是什么？,血液 100mL,重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒(méi)有黃色,洗滌的目的： 除去雜蛋白（血漿蛋白）,及時(shí)分離,2.血紅蛋白的釋放,閱讀思考： 釋放血紅蛋白過(guò)程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？ 為了加速釋放過(guò)程，采取了什么措施？,分析： 蒸餾水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀。,使紅細(xì)胞大量吸水脹裂,溶解

5、紅細(xì)胞的細(xì)胞膜,加速紅細(xì)胞的破裂,紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。,濾紙,過(guò)濾,分離脂類(lèi)物質(zhì)和紅細(xì)胞破碎物沉淀層,3.分離血紅蛋白,紅細(xì)胞 混合液,燒杯,有機(jī)溶劑,血紅蛋白,有機(jī)溶劑（甲苯層,無(wú)色） 脂類(lèi)物質(zhì)（沉淀層，白色） 血紅蛋白溶液（紅色） 紅細(xì)胞破碎物沉淀（暗紅色）,分出血紅蛋白,分液漏斗,4.透析血紅蛋白,透析的目的是什么？,去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì),透析袋？,磷酸緩沖液？（透析12h),能使小分子自由進(jìn)出， 大分子保留在袋內(nèi),純化凝膠色譜操作,1.凝膠色譜柱的制作：,2.凝膠色譜柱的裝填：,教材圖519,3.樣品的加入和洗脫,立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h（裝填緊密）,洗滌平衡,一次

6、性緩慢倒入；輕輕敲打（裝填均勻）,裝填懸浮液,凝膠顆粒蒸餾水(緩沖溶液）充分溶脹,根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量,色譜柱垂直固定在支架上,配制懸浮液,計(jì)算稱(chēng)量凝膠,固定色譜柱,材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75 20mmol/L磷酸緩沖液 “G”表示什么？75代表什么？,2.凝膠色譜柱的裝填,色譜柱內(nèi)不能有氣泡；裝完后，立即用緩沖液洗滌，平衡凝膠使凝膠裝填緊密。,3.樣品的加入和洗脫,1.調(diào)液面,2.加樣 3.再調(diào)液面,4.洗脫,5.收集,注意：（1）加樣不要破壞凝膠面；（2）用磷酸緩沖液洗脫；（3）連續(xù)收集,純度鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 P69,1. 紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù),離心速度,離心時(shí)間十

7、分重要。 A、洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白 B、離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使白細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。（低速短時(shí)離心） 2. 色譜柱填料的處理： 凝膠顆粒放到洗脫液（或蒸餾水）中充分溶脹。可用沸水浴加熱，不但節(jié)約時(shí)間，還能除去微生物和排除空氣。 3.色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡（會(huì)攪亂洗脫的次序）；洗脫液不能斷流；不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。 4. 色譜柱成功標(biāo)志： 紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。,操作提示：,結(jié)果分析與評(píng)價(jià),血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出分離成功,血紅蛋白的分離,放一支與凝膠柱垂直的日光燈直接檢查加入大分子有色物質(zhì)如藍(lán)

8、色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，若色帶均勻、狹窄、平整裝填成功,凝膠色譜柱的裝填,分層明顯樣品處理完成 分層不明 顯的原因,血液樣品的處理,分析,項(xiàng)目,血紅蛋白的提取和分離,1.隨著人類(lèi)跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做的一步是（ ） A.弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) B.弄清各種蛋白質(zhì)的功能 C.弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程 D.獲得高純度的蛋白質(zhì),D,2.使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于（ ） A.電荷的多少 B.分子的大小 C.肽鏈的多少 D.分子形狀的差異,B,3.用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是（ ） A.相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子 質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) B.相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子 質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) C.相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子 質(zhì)量較大的蛋白質(zhì) D.二者根本無(wú)法比較,A,4.在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是（ ） A.調(diào)節(jié)pH B.維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng) C.防止微生物生長(zhǎng) D.防止血液凝固,D,6.下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的