1、抗球蛋白試驗標準操作規(guī)程1.檢驗目的保證抗球蛋白試驗符合要求。2.檢驗方法 本試驗包括“直接抗球蛋白”和“間接抗球蛋白”試驗。2.1直接抗球蛋白試驗2.1.1 原理患者體內(nèi)若有與紅細胞抗原不相合的不完全抗體存在，可與紅細胞結合形成抗原抗體復合物。但因不完全抗體分子量小，不能有效地連接紅細胞，僅使紅細胞處于致敏狀態(tài)。加入抗球蛋白血清，與紅細胞上吸附的不完全抗體結合，在致敏紅細胞之間搭橋，出現(xiàn)肉眼可見的凝集。這種直接檢測體內(nèi)被抗體或(和)補體致敏紅細胞的試驗稱之為直接抗球蛋白試驗。直接抗球蛋白試驗主要用于檢查受檢紅細胞是否在體內(nèi)已被抗體或者補體致敏，用于新生兒溶血病，溶血性輸血反應，自身免疫溶血性

2、貧血，藥物誘導溶血性貧血等檢查。2.1.2.標本EDTA抗凝的靜脈血2.0ml。 2.1.3.試劑多特異性抗球蛋白試劑、抗IgG、抗C3d；2.1.4.器材 離心機、小試管、刻度吸管或加樣器（50200l）、37水浴箱等。2.1.5.操作步驟2.1.5.1.取3支試管分別加入多特異性抗球蛋白試劑、抗IgG、抗C3d試劑各1滴，然后再加1滴受檢者三洗后的2-3%紅細胞懸液，混勻。2.1.5.2. 各反應管以3000r/min離心10秒，持一定的角度輕輕地搖動試管直到松動所有細胞。先用肉眼觀察管底紅細胞的凝集，再用低倍鏡觀察。2.1.5.3.對照：用IgG致敏細胞（抗D血清加Rh陽性細胞，37水浴

3、30分鐘，洗3次配成3%紅細胞鹽水懸液）作為多抗及單抗IgG的陽性對照，陰性對照用正常人AB型血清與正常人“O”型紅細胞反應。2.1.6.結果判斷先觀察陰性和陽性對照管，陰性對照管無凝集，陽性對照管出現(xiàn)凝集，說明檢測管結果可信。如被檢測管凝集，直接抗球蛋白試驗陽性，不凝集者為陰性。如實驗結果陰性要加試劑對照細胞檢查，對照陰性實驗結果可靠。2.1.7注意事項2.1.7.1.標本采取后應立即進行試驗，延遲試驗或中途停止可使抗體從細胞中丟失。2.1.7.2.抗球蛋白試劑應按說明書最適稀釋度使用，否則可產(chǎn)生前帶或后帶現(xiàn)象而誤認為陰性結果。2.1.7.3.受檢紅細胞一定要用鹽水洗滌3次，除去紅細胞懸液中

4、混雜的血清蛋白，以防止假陰性結果。2.1.7.4.最好對陰性結果進行核實，即在該試管中再加1滴IgG致敏紅細胞，如結果為陽性，則表示試管內(nèi)的抗球蛋白試劑未被消耗，陰性結果可靠。2.1.7.5.紅細胞上吸附抗體太少或Coombs試驗陰性的自身免疫性溶血性貧血患者，直接抗球蛋白試驗可呈假陰性反應。2.2.間接抗球蛋白試驗2.2.1. 原理用已知抗原的紅細胞檢測受檢者血清中相應的不完全抗體；或用已知的不完全抗體檢測受檢者紅細胞上相應的抗原。在37條件下孵育，若被檢血清或紅細胞有對應的不完全抗體或抗原，抗原抗體作用使紅細胞致敏，再加入抗球蛋白試劑，與紅細胞上不完全抗體結合，出現(xiàn)肉眼可見凝集。這種通過體

5、外將人血清致敏紅細胞后，再檢測紅細胞上有無不完全抗體或補體吸附的試驗稱為間接抗球蛋白試驗（indirect anti-globulin test，IAT）。主要用于檢測受檢者血清中游離的不規(guī)則抗體，可應用于抗體篩查，抗體鑒定，血型抗原鑒定及交叉配血實驗等。2.2.2.標本EDTA抗凝的靜脈血2.0ml。2.2.3.試劑多特異性抗球蛋白試劑、IgG、C3d；已知抗體血清（用于檢測特殊紅細胞抗原）；5已知抗原的紅細胞鹽水懸液（用于檢測血清中不完全抗體）；2-3 D陽性紅細胞鹽水懸液（陽性對照用）；不完全抗D血清；AB型血清。2.2.4.器材 離心機、小試管、刻度吸管或加樣器（50200l）、37水

6、浴箱2.2.5操作步驟2.2.5.1.收到標本和檢測申請單 , 先核對標本的試管編號或 / 和姓名與申請單上內(nèi)容是否相符。 做好標本接收記錄。2.2.5.2.取小試管 4 只 , 標記并分別加入待檢血漿 2 滴。2.2.5.3. 以上 4 管中分別加入抗體篩選細胞、以及自身紅細胞懸液各 1 滴 , 混勻。 2.2.5.4.另取小試管1只做陽性對照：加入3%D陽性細胞，再加入IgG抗D血清2滴。2.2.5.5.另取小試管1只做陰性對照：加入3%D陽性細胞，再加入AB型血清2滴。2.2.5.6.各反應管混勻，置 37 水浴箱孵育 30 分鐘 。2.2.5.7. 將各管中紅細胞用生理鹽水洗滌三次 ,

7、 末次離心后必須盡量棄去上清液（在吸水紙上扣干）。 2.2.5.8.各管加多特異性抗球蛋白試劑各 l滴 , 混勻 , 以3000r/min離心10秒, 肉眼判斷紅細胞凝集情況。2.2.6.結果判定2.2.6.1. 抗體篩選細胞、號 3 管中任一管出現(xiàn)凝集 , 并且“自身對照”管中無凝集現(xiàn) 象自則表明間抗試驗陽性。2.2.6.2. 抗體篩選細胞、號 3 管均不凝集 , 則表明間抗試驗陰性。2.2.7.注意事項2.2.7.1.紅細胞洗滌應迅速、徹底。要將生理鹽水用力沖入管底，使管底紅細胞松散分離。要防止手上的蛋白質(zhì)污染。1滴14000稀釋的血清可中和抗球蛋白血清1滴，導致假陽性結果。2.2.7.2.離心速度和時間非常重要，應取能使陽性對照管出現(xiàn)陽性反應的最小離心力和最短離心時間。2.2.7.3. 當紅細胞上抗體數(shù)量較少，可通過反復離心、搖動，再離心的方法，增加抗原抗體的接觸，提高陽性率。2.2.7.5.如果檢測的抗體為補體依賴抗體，則必須加入新鮮AB型血清，抗球蛋白血清中也應含有抗C3。2.2.8.紅細胞洗滌本方法適合于少量紅細胞的試管法洗滌 , 紅細胞的量不超過 5 滴 25% 紅細胞懸液中含有的紅細胞。2.2.8.1.搖動試管 , 使試管中不存在貼壁的紅細胞。2.2.8.2.向試管中加入鹽水 , 約至試管總容量 2/3 處。