1、第2節(jié)蛋白質(zhì)的提取和分離,學習導航 1.嘗試蛋白質(zhì)的提取和分離。 2解釋蛋白質(zhì)提取和分離的基本原理。,一、乳酸脫氫酶同工酶的提取和分離 1實驗原理 (1)特點：可以與特定的底物進行反應，形成特殊的藍紫色產(chǎn)物。 (2)提取時的要求：必須提供必要的_ 和_環(huán)境以保持其生物活性。 (3)分離方法：_。,緩沖系統(tǒng),低溫,瓊脂糖凝膠電泳,2實驗步驟 (1)提取過程 制備勻漿：取5 g_的動物心臟，漂洗干凈后、剪碎到預冷的玻璃勻漿器中，加入25 mL_、_研磨成勻漿 獲取酶：將勻漿收集到冰浴的離心管中，在4 條件下12000 rpm離心10 min。吸取_ 在4 條件下保存?zhèn)溆?新鮮,磷酸提取緩沖液,冰浴

2、,上清液,(2)分離過程 制瓊脂糖凝膠電泳板：用_配制質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠，加熱溶解后混勻，緩緩倒入膠床中，插入適當?shù)氖嶙?，室溫冷卻至凝膠凝固。拔出梳子，將凝膠放入 _中，向電泳槽中加入適量的TBE電泳緩沖液 ,TBE電泳緩沖液,電泳槽,加樣、電泳：取適量同工酶提取液與_ 的_混勻，取20L加入 _內(nèi)，100 V條件下進行電泳30 min。 染色、觀察：當溴酚藍指示劑電泳到 _時切斷電源，取出凝膠板浸入染色液中，37 染色1530 min后，取出 _，觀察電泳結(jié)果,等量,載樣緩沖液,樣品孔,凝膠底部,水洗,為什么提取乳酸脫氫酶同工酶時選擇的材料要用新鮮的？ 【提示】新鮮的材料細胞中酶的活

3、性高。,想一想,二、相關(guān)基礎知識 1同工酶 指催化相同的化學反應，而酶蛋白的 _、_乃至免疫學性質(zhì)不同的一組酶。 2乳酸脫氫酶 (1)種類：一般含有5種同工酶。 (2)特點：相對分子質(zhì)量相同，但所帶電荷不 同，電泳的結(jié)果應該形成_個條帶。,分子結(jié)構(gòu),理化性質(zhì),5,(1)同工酶之間的空間結(jié)構(gòu)一定不同() (2)乳酸脫氫酶的催化底物是乳酸() (3)乳酸脫氫酶同工酶具有不同凈電荷、相同的分子大小和形狀(),判一判,1概念 指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。 2原理 不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力方向、大小、阻力不同，導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不

4、同。,3常用方法 (1)瓊脂糖凝膠電泳：由于瓊脂糖本身不帶電 荷，所以，各種分子在電場中的遷移速度因各種分子的帶電性質(zhì)差異、分子大小、形狀不同而不同，從而得以分離。 (2)聚丙烯酰胺凝膠電泳,右圖表示對某蛋白質(zhì)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果(相似于紙層析法分離色素)，下列相關(guān)敘述不正確的是(),A蛋白質(zhì)上某些基團解離后可使蛋白質(zhì)帶電，電場中帶電的蛋白質(zhì)分子(或多肽)會向著與其所帶電荷相反的電極移動 B蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠中的遷移速度完全取決于其所帶凈電荷多少 C蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠中的遷移速度主要取決于相對分子質(zhì)量的大小、形狀、所帶凈電荷 D電泳結(jié)果表明溶液中蛋白質(zhì)可能有兩種,【解析】蛋白質(zhì)的氨基與

5、羧基可發(fā)生解離，使其帶正電或負電，在電場中發(fā)生遷移。蛋白質(zhì)在凝膠中遷移速率主要取決于其所帶凈電荷的多少和性質(zhì)、分子的大小和性狀。 【答案】B,(1)如果蛋白質(zhì)指的乳酸脫氫酶同工酶，B選項說法正確嗎？ (2)如果是乳酸脫氫酶同工酶，電泳結(jié)果會出幾條色帶？ 【提示】(1)正確，因為乳酸脫氫酶同工酶相對分子質(zhì)量相同，所帶凈電荷不同。 (2)5條。,互動探究,1凝膠材料 所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的，如葡聚糖或瓊脂糖。小球體內(nèi)部有許多貫穿的通 道。,2原理 凝膠色譜法也稱作分配色譜法，是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。分子量大的分子通過多孔凝

6、膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。,用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，分子量大的蛋白質(zhì)() A路程較長，移動速度較慢 B路程較長，移動速度較快 C路程較短，移動速度較慢 D路程較短，移動速度較快,【答案】D,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法中加入SDS的作用是() A增大蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量 B改變蛋白質(zhì)分子的形狀 C掩蓋不同蛋白質(zhì)分子間的電荷差別 D減少蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量,變式訓練,解析：選C。在樣品和凝膠中加入SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白質(zhì)SDS復合物，所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，這樣就消除了不同分

7、子間的電1荷差異和結(jié)構(gòu)差異，從而達到僅根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的不同而分離蛋白質(zhì)的目的。,對凝膠色譜法和電泳法分離蛋白質(zhì)混淆不清 有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是() A它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法 B它們的原理相同 C使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要 D以上說法都正確,【解析】凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的一種有效方法；電泳法是利用待測樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異和分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離或鑒定。所以A正確，B錯；這兩種方法都用到緩沖溶液，以調(diào)節(jié)溶液的酸堿度，所以C錯誤。綜上所述，答案選A。,【答案】A 【糾錯總結(jié)】(1)分離不同蛋白質(zhì)的基本原理 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異分離蛋白質(zhì)。如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等。 (2)緩沖溶液 無論是凝膠色譜法還是電泳法均使用緩沖溶液，其目的是維持蛋白質(zhì)的活性，或維持蛋白質(zhì)所帶電荷。,(