1、企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程微生物污染控制實(shí)例分析-無(wú)菌制劑生產(chǎn)過(guò)程微生物菌庫(kù)的建立和種屬鑒定,一、立項(xiàng)目的 二、采樣方案 三、試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備 四、鑒定方法 五、鑒定結(jié)果 六、結(jié)果分析 七、討論,（1）為了了解無(wú)菌制劑生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染情況，即微生物種類(lèi)及分布情況，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)環(huán)境微生物、操作過(guò)程微生物與藥品中污染微生物的比較和溯源分析，以便達(dá)到生產(chǎn)過(guò)程微生物實(shí)時(shí)有效動(dòng)態(tài)控制目的。從而滿(mǎn)足藥品GMP對(duì)無(wú)菌制劑生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染的監(jiān)測(cè)和控制要求。 （2）生產(chǎn)企業(yè)也可以利用這些數(shù)據(jù)，對(duì)無(wú)菌制劑生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。,一、立項(xiàng)目的,1. 采樣區(qū)域的確定 2.采樣對(duì)象及方式的確定 3.采樣頻次的確定,二、采

2、樣方案,根據(jù)車(chē)間的面積、房間數(shù)，考慮到可能影響到產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵區(qū)域及易于受到微生物污染的關(guān)鍵部位的分布，設(shè)定了監(jiān)測(cè)點(diǎn)及采樣方案。 企業(yè)按照中國(guó)新版藥品GMP的要求，將潔凈區(qū)劃分為A級(jí)（動(dòng)態(tài)100級(jí)）、B級(jí)（靜態(tài)100級(jí)）、C級(jí)（10000級(jí)）、D級(jí)（100000級(jí)）。 微生物采樣點(diǎn)分布圖見(jiàn)圖1和圖2。其中一車(chē)間采樣點(diǎn)共39個(gè)，二車(chē)間采樣點(diǎn)共98個(gè)。,1. 采樣區(qū)域的確定,1. 采樣區(qū)域的確定（一車(chē)間）,1. 采樣區(qū)域的確定（二車(chē)間）,人員：手套印記 表面接觸（頭、胸、 手腕、肘、膝蓋） 環(huán)境：沉降菌（ A級(jí)、B級(jí)、 C級(jí)） 浮游菌（A級(jí)、B級(jí)）,2.采樣對(duì)象及方式的確定,企業(yè)根據(jù)生產(chǎn)情況和制劑

3、車(chē)間的使用頻次按季度制定采樣頻次 ，共收集4個(gè)季度的樣本。,3.采樣頻次的確定,1樣本來(lái)源 2培養(yǎng)基 3儀器設(shè)備 4試劑試藥,三、試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備,1樣本來(lái)源 無(wú)菌制劑一車(chē)間和二車(chē)間286份樣本 2培養(yǎng)基 胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），批號(hào)：1221965，BD公司； 麥康凱瓊脂（Mac），批號(hào)：1108423, BD公司； MRS瓊脂，批號(hào)：100915，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司,三、試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備,3儀器設(shè)備 全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（Viteck 2 Compact）：法國(guó)生物梅里埃公司； 麥?zhǔn)蠞岫缺葷醿x：法國(guó)生物梅里埃公司； BX 41 光學(xué)成像顯微鏡：日本奧林巴斯公司； 卡瑪薄

4、層色譜成像儀:瑞士CAMAG卡瑪公司。 API RP,三、試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備,4試劑試藥 革蘭氏染色液：青島高科園海博生物科技有限公司； GN鑒定卡、GP鑒定卡、BCL鑒定卡、YST鑒定卡、ANC鑒定卡：法國(guó)生物梅里埃公司。 API RP,三、試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備,鑒定流程圖,四、鑒定方法,1.菌種的純化與復(fù)壯 采集的微生物可能在物理的、化學(xué)的消殺條件下暴露 了較長(zhǎng)時(shí)間，菌株本身可能存在一定的損傷和變異 ，有必 要對(duì)送檢菌株進(jìn)行復(fù)壯和再次純化。 首選的復(fù)壯及純化培養(yǎng)基為胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 （TSA）;對(duì)于革蘭氏陰性菌，在無(wú)法與革蘭氏陽(yáng)性菌區(qū)分 的情況下，也會(huì)選擇MaC瓊脂作為純化培養(yǎng)基；對(duì)于較

5、難 培養(yǎng)的菌株，也采用血平板、改良MRS瓊脂等進(jìn)行純培 養(yǎng)。,四、鑒定方法,四、鑒定方法短小芽孢桿菌,溶血葡萄球菌,四、鑒定方法,施氏假單胞菌,四、鑒定方法,2.革蘭氏染色及鏡檢 表皮葡萄球菌,四、鑒定方法,2.革蘭氏染色及鏡檢 緩慢芽孢桿菌,四、鑒定方法,2.革蘭氏染色及鏡檢 施氏假單胞菌,四、鑒定方法,3.生化鑒定 （1）采用全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（Viteck 2 Compact），根據(jù)革蘭染色結(jié)果選擇鑒定卡。 （2）將24小時(shí)培養(yǎng)物，用0.45%無(wú)菌氯化鈉 溶液制備一定濁度的菌懸液，將64個(gè)生化反應(yīng) 集成到Viteck鑒定卡上，一般2-10小時(shí)左右給出 鑒定結(jié)果 。 （3）結(jié)果判斷：相

6、似度96%-99%為極好，95%-92%為較好，91%-89%為好，88%-85%為可以接受，85%以下的相似度為低分辨率的鑒別。對(duì)于只鑒定到屬的鑒別，還需根據(jù)提示信息進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，進(jìn)一步甄別到種。,四、鑒定方法,（一）人員環(huán)境總體結(jié)果 一車(chē)間：110株 其中：人員67株 環(huán)境43株 二車(chē)間：182株 其中：人員133株 環(huán)境49株 總計(jì)：292株，其中陽(yáng)性球菌109株（37.3%） 陽(yáng)性芽孢桿菌 114株（39.0%） 陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌 22株（7.5%） 陰性桿菌 39株（13.4%） 2010-12 2010-12-1,五、鑒定結(jié)果,(二)不同區(qū)域結(jié)果 一車(chē)間主要區(qū)域,五、鑒定結(jié)果,(二)

7、不同區(qū)域結(jié)果 一車(chē)間主要區(qū)域,五、鑒定結(jié)果,(二)不同區(qū)域結(jié)果 二車(chē)間主要區(qū)域,五、鑒定結(jié)果,(二)不同區(qū)域結(jié)果 二車(chē)間主要區(qū)域,五、鑒定結(jié)果,（三）不同季節(jié)鑒定結(jié)果 第一季度： 本季度陽(yáng)性芽孢桿菌的檢出率最高，達(dá)到了44.9%；陽(yáng)性球菌的檢出率居第2位為43.5%，陽(yáng)性桿菌的檢出率為7.2%，陰性桿菌的檢出率為4.3%。,五、鑒定結(jié)果,（三）不同季節(jié)鑒定結(jié)果 第二季度： 在本季度，陽(yáng)性芽孢桿菌的種群占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，為54.2%；陽(yáng)性球菌的檢出率為33.6%；陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌和陰性桿菌的檢出率均為5.6%。,五、鑒定結(jié)果,（三）不同季節(jié)鑒定結(jié)果 第三季度： 在本季度，陽(yáng)性球菌的檢出率為38.3

8、%，陰性桿菌檢出率為31.7%，陽(yáng)性芽孢桿菌檢出率為16.7%， 陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌檢出率為6.7%。,五、鑒定結(jié)果,（三）不同季節(jié)鑒定結(jié)果 第四季度： 本季度陽(yáng)性球菌的檢出率為35.7%，陰性桿菌的檢出率為21.4%，陽(yáng)性芽孢桿菌的檢出率為26.8%，陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌的檢出率為12.5%。,五、鑒定結(jié)果,食品微生物方法標(biāo)準(zhǔn),1、生產(chǎn)過(guò)程微生物污染結(jié)果分析 通過(guò)以上樣本鑒定結(jié)果，可以看出，生產(chǎn)過(guò)程微 生物污染主要來(lái)源于人員及人員不當(dāng)?shù)牟僮鬟^(guò)程。環(huán)境 的微生物種類(lèi)與人員表面微生物種類(lèi)基本一致，主要是 革蘭陽(yáng)性的葡萄球菌屬和革蘭陽(yáng)性的芽孢桿菌。,六、結(jié)果分析,2.不同季節(jié)微生物污染趨勢(shì)變化 一車(chē)間： 從

9、2010年第3季度到2011年第2季度，一車(chē)間革蘭氏陽(yáng)性球菌檢出率始終維持在40%50%的區(qū)間范圍內(nèi)；革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌檢出率在10%上下徘徊；放線菌、霉菌、酵母菌僅在2010年第3季度零星檢出；革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)；革蘭氏陰性桿菌呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。,六、結(jié)果分析,2.不同季節(jié)微生物污染趨勢(shì)變化 二車(chē)間： 從2010年第4季度到2011年第2季度，二車(chē)間革蘭氏陽(yáng)性球菌檢出率在30%50%的區(qū)間范圍內(nèi)；革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌檢出率在10%上下徘徊；放線菌在2010年第4季度和2011年第2季度零星檢出；革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)；革蘭氏陰性桿菌呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。,六

10、、結(jié)果分析,2.不同季節(jié)微生物污染趨勢(shì)變化 1）在第一、二季度，陽(yáng)性芽孢桿菌的種群優(yōu)勢(shì)明顯。 原因分析：北方的第一、二季度由于天氣寒冷干燥，一些在夏秋容易滋生的微生物，如革蘭氏陰性細(xì)菌、霉菌和酵母菌的營(yíng)養(yǎng)體在空氣中明顯減少，而芽孢桿菌的休眠體（芽孢）則相對(duì)增多；另一方面，冬春兩季北方的大氣質(zhì)量較差，空氣中懸浮的塵埃粒子較多，芽孢可以隨塵埃遷入潔凈區(qū)甚至空調(diào)凈化設(shè)備中，并長(zhǎng)期駐留。 2）四個(gè)季節(jié)陽(yáng)性球菌的種群和所占比例基本一致。 提示：陽(yáng)性球菌的種群受季節(jié)性因素影響較小。,六、結(jié)果分析,2.不同季節(jié)環(huán)境微生物鑒定結(jié)果分析 ： 3）在第三季度（夏季），陰性桿菌的檢出率較高，陽(yáng)性芽孢桿菌的檢出率為四

11、個(gè)季度中的最低。 提示：夏季優(yōu)勢(shì)菌群為陽(yáng)性球菌和陰性桿菌。,六、結(jié)果分析,1.主要微生物污染源 通過(guò)上述分析，296株菌中有200株來(lái)自于人員表面接觸皿，可見(jiàn)得無(wú)菌制劑生產(chǎn)過(guò)程微生物最大的污染源就是人，人員的數(shù)量和活動(dòng)將直接影響著整個(gè)潔凈區(qū)的環(huán)境質(zhì)量。提示要嚴(yán)格控制操作人員的衛(wèi)生狀況和無(wú)菌操作技術(shù)。 2.根據(jù)微生物分布情況，制定合理的控制措施 通過(guò)上述分析，根據(jù)不同季節(jié)的生產(chǎn)過(guò)程微生物的主要種群分布趨勢(shì)，選擇適宜的消殺方法和適當(dāng)?shù)目刂拼胧_(dá)到更好控制人員和生產(chǎn)環(huán)境的目的。,七、討論,3.方法尚存在問(wèn)題，有待進(jìn)一步改進(jìn) 本次考察是對(duì)無(wú)菌制劑生產(chǎn)過(guò)程微生物污染情況的初步探索研究，主要采用法國(guó)生物梅里埃全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（Viteck 2 Compact）進(jìn)行鑒定，由于數(shù)據(jù)庫(kù)的原因，一些革蘭陽(yáng)性無(wú)芽