1、小麥胚芽中酸性磷酸酶的分離純化,臨床生物化學(xué)教研室,酶分離純化的過程,選擇原料 組織及細(xì)胞破碎 酶的抽提 酶的純化,常用的酶分離純化方法,鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 離心法 電泳法 層析法 吸附法 透析法,一、實驗?zāi)康?掌握小麥胚芽中分離純化ACP的原理 熟悉小麥胚芽中分離純化ACP的操作過程 了解常用的酶分離純化技術(shù),二、實驗原理,酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP) 廣泛分布于自然界中，存在植物種子、霉菌、以及動物肝臟和前列腺中。 植物種子中的ACP在發(fā)芽時含量會猛增，隨芽胚的生長ACP含量會下降。選用新鮮小麥胚芽作為原料來分離和純化ACP，具有來源方便、酶含量高等優(yōu)點。,二

2、、實驗原理,ACP能溶解于水和稀緩沖液中； 溶于35%飽和度的硫酸銨溶液中，在57%飽和度的硫酸銨溶液中可沉淀析出； pH小于6.5時穩(wěn)定性增加，乙酸和枸櫞酸可增加ACP溶液的穩(wěn)定性； 在中性及高溫條件下不穩(wěn)定，在70時相對穩(wěn)定； Mn2+、Mg2+為ACP激活劑，而Cu2+、Pi、Hg2+、Zn2+、Ag+、Pb2+、NaF、草酸鹽、酒石酸鹽和甲醛等是ACP的抑制劑。,三、實驗試劑,1mol/L MnCl2溶液 飽和(NH4)2SO4 溶液(pH 5.5，4) 按76.7g (NH4)2SO4，加蒸餾水溶解至100ml 0.25 mol/L EDTA鈉鹽溶液(pH 5.7) 甲醇-30預(yù)冷

3、新鮮麥芽50 g,四、操作步驟,1.小麥胚芽的準(zhǔn)備 選取飽滿、新鮮的小麥粒，冷水洗滌，除去干癟的麥粒及泥沙，再用冷水浸泡24d (天熱時4h左右)使麥粒發(fā)脹。將發(fā)脹的麥粒平攤于瀝水的覆蓋有2層紗布的塑料筐中，上面覆蓋雙層濕的紗布，置于通風(fēng)處，每天澆水23次，保持麥粒的濕度。一般情況下，發(fā)脹的麥粒在室溫20情況下，經(jīng)34d就可以發(fā)出胚芽。在此過程中應(yīng)注意通風(fēng)透氣，否則麥粒會發(fā)霉。,四、操作步驟,2.小麥胚芽中ACP的初步提取 稱取新鮮小麥胚芽50g，加冷蒸餾水100ml，用搗碎器在高速、間斷條件下冰浴搗碎35min，得到麥芽勻漿，將麥芽勻漿用24層紗布過濾，盡量將液體擠出，棄去紗布上固體物。,四

4、、操作步驟,3.ACP的純化 本實驗采用分級離心+分段鹽析法+熱變性+有機(jī)溶劑沉淀法： ACP與其它成分（細(xì)胞膜、雜蛋白）密度不同，以此逐步離心分離； ACP能溶解于水和低飽和度的硫酸銨溶液，在70C仍保持穩(wěn)定，以此進(jìn)行雜蛋白的變性沉淀和分段鹽析。,ACP分離純化的步驟流程,小麥胚芽50g+100ml冷蒸餾水,濾 液（固體物棄去）,研碎，4層紗布過濾,7000 rpm，離心5min,記錄體積上清液 I 留3ml置于冰箱,9000 rpm，離心5min,1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液 I,記錄體積上清液 II 留3ml置于冰箱,（激活并穩(wěn)定ACP， 沉淀雜蛋白）,緩慢攪拌,7

5、000rpm，離心5min,上清液,7000rpm，離心5min,飽和硫酸銨 54ml /100ml上清液 II， 達(dá)35%飽和度,上清液 II,（溶解ACP， 沉淀雜蛋白）,7000rpm，離心5min,記錄體積上清液 III 留3ml置于冰箱,62C水浴2min，迅速冷卻至68 冷水浴3min,飽和硫酸銨 51ml /100ml上清液， 達(dá)57%飽和度,沉淀（酶粗提物）,（ 沉淀ACP）,緩慢攪拌,緩慢攪拌,ACP分離純化的步驟流程,9000rpm，離心5min,約1/3上清液 III蒸餾水溶解、洗滌,（溶解ACP， 沉淀雜蛋白）,7000rpm，離心5min,記錄體積上清液 IV 留3m

6、l置于冰箱,沉淀（酶粗提物）,（ 沉淀ACP）,EDTA0.09ml/1ml、飽和硫酸銨0.1ml /1ml、-30預(yù)冷甲醇2ml/1ml上清液 IV,沉 淀（酶純化物）,7000rpm，離心5min,10ml蒸餾水 溶解洗滌,（酶液）記錄體積上清液 V 全部保留置于冰箱,ACP分離純化的步驟流程,（ 溶解ACP）,五、注意事項,制備小麥胚芽時不宜讓麥苗長出，盡量取小麥胚芽部分，因麥粒和麥苗部分ACP活性較低。同時要棄去發(fā)霉變質(zhì)的麥胚。 1 mol/L MnCl2起穩(wěn)定酶蛋白和除去雜蛋白的作用。 (NH4)2SO4的最終飽和度要嚴(yán)格控制，ACP溶于35%飽和度的(NH4)2SO4溶液中，一些雜蛋白沉淀析出。當(dāng)(NH4)2SO4飽和度增加至57%時，ACP則不溶解，從溶液中析出，某些雜蛋白仍溶于上清液中。,操作中要控制好要求的溫度，ACP在70時穩(wěn)定，加熱至62為了除