1、分子生物學實驗實驗報告實驗名稱：生物樣本中蛋白質的提取及測定姓 名： 陳 杰 學 號： 3140104666 組 別： 同組同學： 唐陳曦 帶教教師： 劉偉 俞萍 實驗日期： 2015年9月15日 目錄1.原理：31.1生物樣本中蛋白質的提取31.2生物樣本中蛋白質的測定31.2.1 lowry法31.2.2 考馬斯亮藍法31.2.3 紫外吸收法42.操作步驟42.1生物樣本中蛋白質的提取42.2生物樣本中蛋白質的測定42.2.1 lowry法42.2.2 考馬斯亮藍法52.2.3紫外吸收法53、實驗結果53.1 原始數(shù)據(jù)53.1.1 lowry法53.1.2 考馬斯亮藍法63.1.3 紫外吸

2、收法63.2 數(shù)據(jù)處理73.2.1 lowry法73.2.2 考馬斯亮藍法83.2.3 紫外吸收法94.討論：101.原理：1.1生物樣本中蛋白質的提取離體不久的組織，在適宜的溫度及ph等條件下，可以進行一定程度的物質代謝。因此，在生物化學實驗中，常利用離體組織來研究各種物質代謝的途徑與酶系作用，也可以從組織中提取各種代謝物質或酶進行研究。但生物組織離體過久，其所含物質的含量和生物活性都將發(fā)生變化。例如，組織中的某些酶在久置后會發(fā)生變性而失活；有些組織成分如糖原、atp等，甚至在動物死亡數(shù)分鐘至十幾分鐘內，其含量即有明顯的降低。因此，利用離體組織作代謝研究或作為提取材料時，都必須迅速將它取出，

3、并盡快地進行提取或測定。一般采用斷頭法處死動物，放出血液，立即取出實驗所需的臟器或組織，除去外層的脂肪及結締組織后，用冰冷的生理鹽水洗去血液（必要時可用冰冷的生理鹽水灌注臟器以洗去血液），再用濾紙吸干，即可用于實驗。取出的臟器或組織，可根據(jù)不同的方法制成不同的組織樣品。包括組織糜、組織勻漿、組織浸出液。由于動物肝臟細胞比較脆弱，易于破碎，故本實驗選用小鼠肝臟細胞作為實驗材料，采用勻漿法法將其破碎，然后加入樣品提取液使蛋白質溶解，用高速離心法棄去細胞碎片。收集上清液后可進行蛋白質定量分析。1.2生物樣本中蛋白質的測定1.2.1 lowry法1921年，folin發(fā)明了folin-酚試劑法測定蛋白

4、質的濃度，反應原理是利用蛋白質分子中的酪氨酸和色氨酸殘基還原酚試劑（磷鎢酸-磷淚酸）生成藍色化合物；1951年lowry對上述方法進行了改進，讓蛋白質先與堿性銅試劑進行反應，然后再與酚試劑反應，改進后的方法可以使反應的靈敏度提高。蛋白質中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子結合形成復雜的紫色或紫紅色絡合物（類似雙縮脲反應）。由于蛋白質中芳香族氨基酸殘基(酪氨酸）的存在，該絡合物在堿性條件下進而與folin-酚試劑形成藍色復合物。上述呈色反應的顏色深淺在一定范圍內與蛋白質含量成正比。通過與已知含量的標準蛋白質的生色結果進行比較分析，即可檢測待測樣品的蛋白質含量。目前實驗室常規(guī)的快速定量測定蛋白質含量方法

5、中，以lowry等人發(fā)展的folin-酣法應 用最為普遍。該方法的優(yōu)點是:靈敏度高（比紫外吸收法靈敏度高1020倍），操作簡單快速，不需復雜的儀器設備。1.2.2 考馬斯亮藍法考馬斯亮藍g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由掠黑色變?yōu)樗{色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的械性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在一定范圍內，考馬斯亮藍g250-蛋白質復合物呈青色，在595nm下，吸光度與蛋白質含量呈線性關系，故可以用于蛋白質含量的測定。1.2.3 紫外吸收法蛋白質中普遍含有酪氨酸與色氨酸，由于這兩種芳香族氨基

6、酸分子中含有大pi鍵，它們在280nm紫外光附近有光吸收，因而使蛋白質在上述紫外光波長附近產生較強的光吸收，利用蛋白質的這一特性可對其進行含量測定。2.操作步驟2.1生物樣本中蛋白質的提取1.用頸椎脫白法處死小鼠，切開腹腔，取下完整肝臟，小心去掉膽囊（不要弄破），放入盛 冷生理鹽水的燒杯中漂洗干凈。2.取小鼠肝整個肝組織，在稱量紙上剪碎，放入玻璃勾裝管中。3.按1:15的比例往玻璃勾紫管中加入勾裝緩沖液（即每份樣品需加預冷的提取緩沖液6ml，蛋白酶抑制劑0.16ml)，手動勻漿。注意用力均勾，以免損壞勻漿管。 4.勻漿完成后，取一支2ml eppendorf管，各加入1.8ml勾衆(zhòng)液后，置入冷

7、凍離心中。5. 5.于4,13000r/min離心20min后，小心取出上清液0.5ml至2mleppendorf管中，加入0.5ml緩沖液，用于蛋白質含量的測定，再取出上清液0.5ml至另一2mleppendorf管中-20保存。2.2生物樣本中蛋白質的測定2.2.1 lowry法1.取16mmxl50mm試管16支，標號，放置在試管架上，在16號試管內分別加入標準牛血清白蛋白（使用時取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/ml）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，用雙蒸水補足至每管總體積0.5ml，在7、8號試管內分別加入待測樣品25、50ul，并用雙蒸水補足至0.5ml(即將待測樣品

8、稀釋20或10倍）。916管作為平行實驗管重復18管的操作并同時進行實驗，取算術平均值作為檢測結果。 2.各管加入2.5ml新配制的堿性銅溶液，立即搖勻，在室溫下放置10min。3.各管加入0.5ml folin 酚試劑應用液，邊加入邊立即充分混合（用振蕩混合器），然后在室溫下放置3060min(不要超過60min)。4.分別用1號和9號管作為空白對照調零，檢測其余標準樣品管及待測樣品管在550nm波長處的吸光度值。5.根據(jù)已知含量的標準樣品測得的吸光度作標準曲線，然后根據(jù)待測樣品的吸光度在標準曲線上查出其蛋白質含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出小鼠肝臟提取液的蛋白質含量。2.2.2 考馬斯亮藍法1.

9、取16mmx150mm試管16支，標號，放置在試管架上，在16號試管內分別加入標準牛血清白蛋白（使用時取e液用雙蒸水稀釋至0.5mg/ml)0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，用雙蒸水補足至每管總體積0.1ml，在7.8號試管內分別加入稀釋20、10倍的待測樣品0.1ml。 916管作為平行實驗管重復18管的操作并同時進行實驗，取算術平均值作為檢測結果。 2.每管加入考馬斯亮藍g250染料試劑3ml，搖勾，室溫靜置3min3.分別用1號和9號管作為空白對照調零，檢測其余標準樣品管及待測樣品管在595nm 處的吸光度值。4.根據(jù)已知含量的標準樣品測得的吸光度作標準曲線，然后根

10、據(jù)待測樣品的吸光度在標準曲線上查出其蛋白質含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出小鼠肝臟提取液的蛋白質含量。2.2.3紫外吸收法1.取16mmx 150mm試管16支，標號，放置在試管架上，在16號試管內分別加入標準牛血清白蛋白（2mg/ml)0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9ml，用雙蒸水補足至每管總體積3ml，在7,8號試管內分別加入稀釋100,50倍的待測樣品3ml。916管作為平行實驗管重復18管的操作并同時進行實驗，取算術平均值作為檢測結果。2.分別以1號管和9號管作為空白對照調零，用紫外分光光度計(注意用石英比色杯)于波長280nm處比色，記錄各管的吸光度值。3.根據(jù)已知含量的標準樣

11、品測得的吸光度作標準曲線，然后根據(jù)待測樣品的吸光度在標準曲線上查出其蛋白質含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算小鼠肝提取液的蛋白質含量。3、實驗結果3.1 原始數(shù)據(jù)3.1.1 lowry法序 號12345678牛血清蛋白濃度（mg/ml）00.10.20.30.40.5一號組 吸光度值00.1820.3040.4000.4540.4840.3230.519二號組 吸光度值00.1690.3030.3920.4430.4950.3420.517算術平均值00.17550.30350.3960.44850.48950.33250.5183.1.2 考馬斯亮藍法序 號12345678牛血清蛋白濃度（mg/ml）0

12、0.10.20.30.40.5一號組 吸光度值00.1430.2620.3530.4190.5700.4090.739二號組 吸光度值00.1550.2840.3670.5220.5790.4120.780算術平均值00.1490.2730.3600.47050.57450.41050.75953.1.3 紫外吸收法序 號12345678牛血清蛋白濃度（mg/ml）00.20.30.40.50.6一號組 吸光度值00.1330.1970.2560.3240.3800.2290.405二號組 吸光度值00.1160.1970.2550.3160.3840.2000.408算術平均值00.1245

13、0.1970.25550.3200.3820.21450.40653.2 數(shù)據(jù)處理3.2.1 lowry法將y=0.3325代入擬合出的直線：y=0.95971x+0.06224中可得濃度為0.28mg/ ml，原樣品中蛋白質濃度為5.6mg/ml，則原來的濃度為11.2 mg/ml。將y=0.518代入擬合出的直線：y=0.95971x+0.06224中可得濃度為0.48mg/ ml，則原樣品中蛋白質濃度為4.8mg/ml，則原來的濃度為9.6 mg/ml。 取平均值為10.4mg/ml。3.2.2 考馬斯亮藍法將y=0.4105代入擬合出的直線：y=1.12114x+0.02421中可得濃

14、度為0.34mg/ml，則樣品中蛋白質濃度為6.8mg/ml，則原來的濃度為13.6 mg/ml。將y=0.7595代入擬合出的直線：y=1.12114x+0.02421中可得濃度為0.66mg/ml，則樣品中蛋白質濃度為6.6mg/ml，則原來的濃度為13.2 mg/ml。 取平均值為13.4mg/ml。3.2.3 紫外吸收法將y=0.2145代入擬合出的直線：y=0.63886x+0.00021中可得濃度為0.34mg/ml，則樣品中蛋白質濃度為6.8mg/ml，則原來的濃度為13.6 mg/ml。將y=0.4065代入擬合出的直線：y=0.63886x+0.00021中可得濃度為0.64

15、mg/ml，則樣品中蛋白質濃度為6.4mg/ml，則原來的濃度為12.8 mg/ml。取平均值為13.2mg/ml。4.討論：根據(jù)三種方法得出蛋白質的濃度約為13.3 mg/ml（沒有算第一種方法得出的結果，因為方法一中的r-square值只有0.9169），從后兩種方法的回歸線中可以看出還是很符合實驗規(guī)律的。根據(jù)實驗經歷和實驗結果，我更喜歡第二種方法。我們在選擇方法的時候主要考慮：實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質的性質；溶液中存在的干擾物質；測定所要花費的時間。其中l(wèi)owry靈敏度高，不需要復雜儀器，但反應需要的時間較長，操作的用時也有比較高的要求，同時容易受到非蛋白質的影響，例如含

16、有edta，甘氨酸等物質的蛋白就不適合這種方法。之所以第一組數(shù)據(jù)尤其不準，我想與我們組的操作水平不無關系，因為folin-酚試劑只有在酸性條件下穩(wěn)定，但還原反應只在堿性條件下發(fā)生，所以加入的時候要立即混勻，可能這個沒有做好，另外就是實驗室里分光光度計調整用了好久。再就是考馬斯亮藍法，靈敏度高，測定簡便，只要加一種試劑，而且染料的顏色可以在較長時間內保持穩(wěn)定。我們組做實驗的時候是先一起做完lowry法和考馬斯亮藍法之后去測定的，而調整分光光度計用時了很久，所以這種方法即時過了一段時間，測出來的數(shù)據(jù)也還很準，不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。并且該法干擾物質很少，像k+,na+，mg+離子，edta等等的都不干擾。使用過考馬斯亮藍染液的比色杯比較難清洗，可以用乙醇脫色后再用清水清洗，注意少量多次。最后是紫外吸收法，相對于前兩種方法最大的優(yōu)勢就是速度很快，操作很簡單，也不需要消耗樣品，測定后能回收使用。如果要測定來源比較珍貴的，不容易獲取的蛋白質濃度可以考慮這種方法。不過也有很多缺點，例如準確度較差、如果樣品中有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現(xiàn)較大的干擾，同時敏感度也比較低，對蛋白的濃度要求較高。注意測試時必須使用石英比色杯。同時有幾