分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)目的、意義、分類,目的： 分離培養(yǎng)臨床標(biāo)本中的分枝桿菌 意義： 診斷結(jié)核病金標(biāo)準(zhǔn) 獲得菌株鑒定試驗純培養(yǎng)物 獲得藥敏試驗所需的純培養(yǎng)物 療效評估分類：簡單法:酸性羅氏培養(yǎng)法離心集菌法：中性羅氏培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法（如MGIT960液體培養(yǎng)法）,結(jié)核分枝桿菌生長要求,專性需氧菌最適生長溫度為37最適PH為6.57.2營養(yǎng)要求：氮源、碳源、無機鹽（磷、鐵、鎂、鉀、硫等）、生長因子,結(jié)核分枝桿菌生長特點,生長緩慢：在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要18-24小時，一般10-30天肉眼可見菌落生長。菌落形態(tài)（羅氏培養(yǎng)基）：粗糙、凸起、致密，有表面皺折，呈顆粒、結(jié)節(jié)或菜花樣，淺黃色或米色，不透明（ 液體培養(yǎng)基：絮狀或顆粒狀沉淀。）,簡單法操作步驟,痰標(biāo)本2-3ml,12倍4% NaOH,振蕩勻化,靜置15分鐘,均勻接種0.1ml,2支,斜面朝上，放置24小時,37，培養(yǎng)8周,簡單法掌握要點,1、原理2、標(biāo)本類型3、儀器設(shè)備4、試劑耗材5、操作注意事項6、結(jié)果判讀7、質(zhì)量控制8、討論,一、原理,分枝桿菌因較厚的細(xì)胞壁有耐受酸堿的特點，能耐受堿性消化液的處理，消化液直接接種于酸性培養(yǎng)基上，酸性培養(yǎng)基能中和堿性標(biāo)本處理液，分枝桿菌能在酸性的培養(yǎng)基上生長 2%NaOH 4%NaOH 4%H2SO4注：不同濃度消化處理液對結(jié)核菌生長的影響,二、標(biāo)本類型,痰、BF、體液（胸腹水、尿液、CSF等）、大便、組織等 注： 標(biāo)本是否留取合格 不同標(biāo)本類型的不同前處理過程 保存方法,三、儀器設(shè)備,1、II級生物安全柜2、恒溫培養(yǎng)箱3、漩渦振蕩器4、冷凍離心機5、天平6、高壓滅菌鍋,四、試劑耗材,1、 4%NaOH2、酸性羅氏培養(yǎng)基成分 味精（谷氨酸鈉）（純度95%以上）7.2g KH2PO4 14 g (中性2.4g) 枸櫞酸鎂 0.6 g MgSO47H2O 0.24 g 甘油（丙三醇） 12ml 蒸餾水 600ml 新鮮雞卵液 1000ml 2%孔雀綠 20ml 85 蒸氣鍋50分鐘注：配制培養(yǎng)基需注意的問題、注意識別不合格培養(yǎng)基,五、操作注意事項,視痰標(biāo)本性狀，加l2倍體積4氫氧化鈉(Na0H)消化液于痰瓶中，渦旋振蕩器振蕩23分鐘，使痰液充分勻化，室溫放置。自加入氫氧化鈉消化液后起，整個處理時間不得超過20分鐘。樣本數(shù)較多時，應(yīng)分批處理。 吸取經(jīng)前處理后的痰液0.1毫升，無菌操作均勻接種在整個培養(yǎng)基斜面。每份標(biāo)本接種兩支酸性羅氏培養(yǎng)基。接種后，37平臥放置斜面24小時。然后，擰緊培養(yǎng)瓶蓋或塞緊試管膠塞，直立放置，37繼續(xù)培養(yǎng)。,六、結(jié)果判讀及報告,分枝桿菌培養(yǎng)陰性： 斜面無菌落生長。分枝桿菌培養(yǎng)陽性(1十)：菌落生長占斜面面積的14。分枝桿菌培養(yǎng)陽性(2十)：菌落生長占斜面面積的12。分枝桿菌培養(yǎng)陽性(3十)：菌落生長占斜面面積的34。分枝桿菌培養(yǎng)陽性(4十)：菌落生長布滿全斜面。 分枝桿菌培養(yǎng)陰性應(yīng)以“(培養(yǎng)陰性)”報告，不能以“()”表示。菌落生長不足以斜面面積14時，實報菌落數(shù)。（對可疑培養(yǎng)陽性標(biāo)本，必須涂片進(jìn)行抗酸染色確診）,六、結(jié)果判讀及報告,注：培養(yǎng)的第3天，之后每周記一次結(jié)果，對可疑的分支桿菌需涂片進(jìn)行抗酸染色,七、質(zhì)量控制,室內(nèi)質(zhì)量控制（QC）室間質(zhì)量評估（EQA）現(xiàn)場評價 (on-site evaluation)：人力物力，難以日常監(jiān)控盲法復(fù)檢 (blinded-rechecking)：痰標(biāo)本用完難以重復(fù)批量測試 (panel testing)：在樣本準(zhǔn)備方面還需要更多的技術(shù)投入培養(yǎng)的質(zhì)量保證目前主要依賴室內(nèi)質(zhì)量控制，輔以定期或不定期的現(xiàn)場評價。,七、質(zhì)量控制,室內(nèi)質(zhì)量控制 人員培訓(xùn)、儀器設(shè)備監(jiān)控、培養(yǎng)基無菌試驗、生長試驗 每月對培養(yǎng)情況培養(yǎng)陽性率、涂陽培陽率和污染率的統(tǒng)計分析涂陽培陽率 公式: 培養(yǎng)陽性的病例總數(shù) 100% 涂片檢查陽性并進(jìn)行培養(yǎng)的病例數(shù) 初診病人涂陽培陽率應(yīng)大于90污染率 公式: 污染的培養(yǎng)管數(shù)量 100% 培養(yǎng)管總數(shù) 污染率應(yīng)小于5%(2-5%)。,涂陽培陽率過低？,污染率過高？,總結(jié)簡單法操作流程,痰標(biāo)本中加入12倍體積4氫氧化鈉渦旋振蕩30-60秒室溫靜置15分鐘接種：0.1ml，2管37C溫箱培養(yǎng)水平向上培養(yǎng)24小時直立放置37C繼續(xù)培養(yǎng)觀察報告結(jié)果：第3天、7天、此后每周一次，直至滿8周,BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)技術(shù),BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)技術(shù),原理：,MGIT960液體培養(yǎng)操作步驟,痰標(biāo)本2-5ml,12倍NaOH(3%)-NALC,振蕩勻化,靜置15分鐘,轉(zhuǎn)至離心管，加PSB至45ml,3000g,離心20分鐘,去上清，加1mlPBS，混懸,接種0.5ml混懸液至快培管，上機,試劑耗材,1、6%NaOH與等量的2.9%檸檬酸鈉混合液2、N-乙酰-L-半胱胺酸（N-acetyl-L-cysteine,NALC） 100ml 6%NaOH-2.9%檸檬酸鈉混合液加1gNALC3、 PH6.8PBS4、 BACTEC MGIT Growth Supplement(營養(yǎng)添加劑：葡萄糖、甘油、油酸、觸酶、白蛋白、維生素B6 HCl）5、 BBL MGIT PANTA(雜菌抑制劑：阿洛西林、萘啶酸、甲氧芐氨嘧啶、多粘菌素B、兩性霉素 B)6、 BBL MGIT 7ml