G 中華人民共和國 國 家標準  9682 2013 食品安全國家標準  水產(chǎn)品中青霉素類藥物 多 殘留 的測定  高效液相色譜法  in 電子版本僅供參考，以標準正式出版物為準）  2013布  2014施  中華人民共和國農(nóng)業(yè)部  中華人民共和國 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會  發(fā)布  I 目   次  目   次  . I 前   言  . 產(chǎn)品中青霉素類藥物多殘留的測定  高效液相色譜法  .  1 范圍  .  2 規(guī)范性引用文件  .  3 原理  .  4 試劑與材料  .  5 儀器和設備  .  6 試料的制備與保存  .  料的制備  .  料的保存  .  7 測定步驟  .  準曲線的制備  .  取  .  化  .  生化  .  定  .  白試驗  .  8 結果計算和表述  .  9 檢驗方法靈敏度、準確度、精密度  .  敏度  .  確度  .  密度  .  附錄 A .     言  本標準的附錄 A 為資料性附錄。  本標準系國內(nèi)首次發(fā)布的國家標準。    水產(chǎn)品中青霉素類藥物 多 殘留 的測定  高效液相色譜法  1 范圍  本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中 4 種青霉素類藥物殘留量檢測的制樣和高效液相色譜測定方法。  本標準適用于魚可食性組織中青霉素 G、苯唑 西林 、雙氯青霉素和乙氧 萘 青霉素 單個或多個藥物殘留量的檢測。  2 規(guī)范性引用文件  下列文件中的條款通過本標準的引用而成 為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其 隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。   準化工作導則  第 1 部分：標準的結構和編寫規(guī)則   6682 分析實驗室 用水規(guī)格和試驗方法  3 原理  試料中殘留的青霉素類藥物， 用乙腈提取， 凈化， 1,2,4氯化汞溶液衍生 ， 高效液相色譜 定，外標法定量。  4 試劑與材料  以下所用的試劑 ，除特別注明外均為分析純試劑， 水符合  6682 規(guī)定的一級水。  霉素 G、 苯唑西林 、 雙氯青霉素 和 乙氧 萘 青霉素 標準品 ： 含量 98%。  醇  腈  水硫代硫酸鈉  水磷酸二氫鈉    水磷酸氫二鈉  酸銨  氧化鈉  己烷  1,2,4氯化汞 （  相萃取柱 ： 60  相當者。  流動 相 A： 取五水硫代硫酸鈉 3.9 g，用水溶解 ，再加入二水磷酸二氫鈉 10.2 g、無水磷酸氫二鈉 4.9 g、硫酸銨 6.8 g，用水溶解， 并 稀釋 至 1 000 濾膜過濾 。  氯化汞（ 液 ：  取氯化汞 （ g，用水溶解 并 稀釋 至 10 配現(xiàn)用。  5  氫氧化鈉 溶液 ： 取氫氧化鈉 20 g，用水溶解 并 稀釋 至 100  衍生化試劑 ： 取 1， 2， 4g，用水 60 解，加 氯化汞溶液 10  5  氫氧化鈉 溶液調(diào)節(jié)  水稀釋到 100 2 8 避光保存，有效期 3 個月。  1 mg/霉素類藥物 標準貯備液 ： 精密 稱 取 青霉素 G、 苯唑西林 、雙氯青霉素和 乙氧萘青霉素 的標準品 各 10 分別 于 10 瓶中， 用水溶解并 稀釋至刻度 ， 配制成濃度為 1 mg/ 青霉素 G、 苯唑西林 、雙氯青霉素和 乙氧萘青霉素 標準貯備液 ， 分裝，立刻于 20 以下 避光保存，有效期 1 個月。使用時不得反復凍融。  10 g/霉素 G 標準工作液： 精密 量取 1 mg/霉素 G 標準 貯備液 1.0 于 100 用水溶解并 稀釋至刻度 ， 配制成濃度為 10 g/ 青霉素 G 標準 工作 液 ， 分裝，立刻于 20以下 避光保存，有效期 1 個月。使用時不得反復凍融。  10 g/唑西林、雙氯青霉素和 乙氧萘青霉素 混合標準工作液： 精密 量取 1 mg/唑西林、雙氯青霉素和 乙氧萘青霉素 標準 貯備液各 1.0 于 100 瓶中， 用水溶解并 稀釋至刻度 ，配制成濃度為 10 g/ 苯唑西林、雙氯青霉素和 乙氧萘青霉素 混合 標準 工作 液 ， 分裝，立刻于 20以 下 避光保存，有效期 1 個月。使用時不得反復凍融。  5 儀器和設備  高效液相色譜儀 ： 配紫外檢測器 。  分析天平 ： 感量 1g。  天平 ： 感量    冷凍高速離心機  恒溫水浴鍋  旋渦混合器  固相萃取裝置  組織勻漿機  氮氣吹干裝置  離心管： 50  濾膜： m。  6 試料的制備與保存  料的制備  魚去鱗、去皮，沿背部取肌肉 組織，或取魚肌肉 +皮組織 ， 絞碎，并使均質(zhì) 。   取均質(zhì) 后的供試樣品，作為供試試料 。   取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料。   取 均質(zhì)后的空白樣品 ， 添加適宜濃度 的 標準 工作液 ， 作為空白添加試料。  料 的保存  以下 保 存。  7 測定步驟  準曲線的制備  分別精密 量取 10 g/霉素 G 標準工作液 及 10 g/唑西林、雙氯青霉素和 乙氧萘青霉素混合標準工作液適量， 用流動相稀釋 ，配制成 青霉素 G 濃度為 20、 50、 100、 200、 400、 800 和 1 600 g/L， 苯唑西林 、雙氯青霉素 和 乙氧萘青霉素 濃度 為 100、 200、 400、 800、 1 600、 3 200 和 6 400 g/合標準溶液 ，各取 500 L，按 衍生化 步驟 操作 ， 供 高效液相色譜 測定 。 以 測 得峰面積為縱坐標，對應的標準溶液 濃度為橫坐標，繪制標準曲線。 求回歸方程和相關系數(shù)。    取  稱取 試料 （ 5g， 于 50 心管中，加 乙腈 15 勻， 加 正己烷 5 渦混 勻 ，  6 000 r/心 15 棄 正己烷層 液 ， 取下 層 液 ， 于 另一離心管中。殘渣中 再 加 乙腈 10 正己烷 5 渦 混勻 ， 6 000 r/心 15 棄 正己 烷層 液 ， 合并兩次下層液 ， 于 40 水浴旋轉蒸干 ， 用 水 5 解 殘余物 ，備用。  化  依次用甲醇 3  水 3 化， 取 備用液過柱， 用 水 1 洗，乙腈 3 脫，收集洗脫液， 于 45 50 水浴氮氣吹干。用流動相 1.0 解 殘余物 ，旋渦 混勻 ， 備用 。  生化  準確量取 備用液 500 L， 于 1.5 丙烯離心管中，加衍生化試劑 500 L，旋渦混勻， 于 65水浴反應 10 速冰浴冷卻， 于 4  10 000 r/心 10 上清液 ， 供高效液相色譜 測定 。  定  譜條件  色譜柱： 250 4.6 徑 5 m） ，或相當者。  流動相： 流動相 A+乙腈（ 65+35， v/v） 。  流速： 1 mL/ 紫外檢測波長： 325  柱溫： 30 。  進樣量： 50 L。  定法  取試樣溶液和相應的標準溶液，作單點或多點校準，按外標法，以峰面積計算 。 標準溶液及試樣溶液中青霉素類藥物響應值應在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。在上述色譜條件下，標準溶液和 空白添加試樣溶液的高效液相色譜圖見附錄 A。    白試驗  除不加 試料外，采用完全相同的步驟進行平行操作。  8 結果計算和表述  單點校準  試料中青霉素類藥物的殘留量（ g/按 下 式 計算     式中：  X 供試 試料中 相應的 青霉素類藥物殘留量 ， g/ A 試樣溶液中 相應 的 青霉素類藥物衍生物峰面積；  標準工作液中 相應 的 青霉素類藥物衍生物峰面積；  標準工作液中 相應 的 青霉素類藥物濃度 ， g/L；  V 衍生化后所得溶液總體積，  m 供試試料 質(zhì)量 ， g。  注：計算結果 需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。  9 檢驗方法靈敏度、準確度、精密度  敏度  本方法青霉素 G 的檢測限為 3 g /定量限為 10 g/苯唑西林 、雙氯青霉素、 乙氧萘青霉素 的檢測限為 10 g/定量限為 50 g / 確度  本方法在 10 600 g /加濃度 水平上 的回收率為 70 110。  密度   本方法 批內(nèi) 相對標準偏差 20%，