第十一章 基因工程藥物檢驗(yàn),基因工程藥物與一般藥物比較：,它是利用活的細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，所獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對(duì)分子質(zhì)量較大，并具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)； 許多基因工程藥物是參與人體一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，極微量就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)。,宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄或翻譯、工藝放大等過程中，都有可能發(fā)生變化。,一、基因工程藥物質(zhì)量要求,(1)要求提供關(guān)于表達(dá)體系的詳細(xì)資料，以及工程菌(或工程細(xì)胞)的特征、純度(是否污染外來因子)和遺傳穩(wěn)定性等資料。 (2)提供培養(yǎng)方法和產(chǎn)量穩(wěn)定性、純化方法以及各步中間產(chǎn)品的收率和純度、除去微量的外來抗原、核酸、病毒或微生物等方法。,(3)要求進(jìn)行理化鑒定，包括產(chǎn)品的特征、純度及與天然產(chǎn)品的一致性。一般純度應(yīng)在95%以上。 (4)要求進(jìn)行外源核酸和抗原檢測，規(guī)定每劑量DNA含量不超過l00pg，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品中小牛血清含量須合格。成品中不應(yīng)含有純化過程中使用的試劑，包括層析柱試劑和親和層析用的鼠IgG。,1、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞 應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料，包括基因的來源、克隆和鑒定、表達(dá)載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。,(一) 原材料的控制,2、克隆基因的序列 應(yīng)提供插入基因和表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達(dá)有關(guān)的序列均應(yīng)詳細(xì)敘述。,3.表達(dá) 應(yīng)詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動(dòng)和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)所采用的方法及表達(dá)水平。,(二)生產(chǎn)的控制,在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定； 在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定， 始終無突變； 在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定； 始終能排除外源微生物污染。,1、原始細(xì)胞庫 應(yīng)詳細(xì)記述種子材料的來源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用壽命；應(yīng)提供在保存和復(fù)蘇條件下宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)；采用新的種子批時(shí)，應(yīng)重新作全面檢定。,2、有限代次的生產(chǎn) 提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性的數(shù)據(jù)；依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)和細(xì)胞倍增數(shù)，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。,3、連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn) 應(yīng)提供經(jīng)長期培養(yǎng)后所表達(dá)基因的分子完整性資料，以及宿主細(xì)胞的表型和基因型特征。,4、純化 對(duì)于收獲、分離和純化的方法應(yīng)詳細(xì)記述，應(yīng)特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除。 對(duì)整個(gè)純化工藝應(yīng)進(jìn)行全面研究，包括能夠去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。,(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制,應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗(yàn)方法。,(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制,1.產(chǎn)品的鑒定 電泳方法 免疫學(xué)分析方法 受體結(jié)合試驗(yàn) 高效液相色譜法 肽圖分析法 Edman N末端序列分析法 圓二色譜法 核磁共振法,(1) 氨基酸成分分析 氨基酸成分分析可為目的產(chǎn)物的純度檢定提供信息。 完整的氨基酸成份分析結(jié)果，應(yīng)包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的準(zhǔn)確值。氨基酸成份分析結(jié)果應(yīng)為三次分別水解樣品測定后的平均值。,(2)肽圖分析,肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜。,肽圖分析可作為與天然產(chǎn)品或參考品作精密比較的手段。與氨基酸成分和序列分析結(jié)果合并，可作為蛋白質(zhì)的精確鑒別。,(3)重組蛋白質(zhì)的濃度測定和相對(duì)分子質(zhì)量測定 蛋白質(zhì)濃度測定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外光譜法等。 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測定最常用的方法有凝膠過濾法和SDS-PAGE法。,(4) 蛋白質(zhì)二硫鍵分析 測定方法有: 對(duì)氯汞苯甲酸法等 5，5-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法,2、 純度分析,(1)目的蛋白質(zhì)含量測定 (2)產(chǎn)物雜質(zhì)檢測,(1)目的蛋白質(zhì)含量測定 測定蛋白質(zhì)含量的方法可根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來設(shè)計(jì)。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜,(2)產(chǎn)物雜質(zhì)檢測 基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩類。 蛋白類雜質(zhì)： 殘留宿主細(xì)胞蛋白 采用免疫分析的方法,非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)：,病毒污染檢查 無菌試驗(yàn) 熱原質(zhì)試驗(yàn) 殘余細(xì)胞DNA測定。 抗原性物質(zhì)檢查 其他外源性物質(zhì),常用檢測方法： 雜質(zhì)和污染物 檢 測 方 法 內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱原法 宿主細(xì)胞蛋白 免疫分析、SDS-PAGE、CE 其它蛋白雜質(zhì) 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE 殘余DNA DNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合 蛋白變異 肽譜、HPLC、 IEF、 CE,3.生物活性(效價(jià))測定,生物活性測定是保證基因工程藥物產(chǎn)品有效性的重要手段，往往需要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)和通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價(jià)測定。,4.穩(wěn)定性考察,藥品的穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)藥品有效性和安全性的重要指標(biāo)之一，也是確定藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。,5、 產(chǎn)品一致性的保證,只有對(duì)從原料、生產(chǎn)到產(chǎn)品的每一步驟都進(jìn)行嚴(yán)格的控制和質(zhì)量檢定，才能確保各批最終產(chǎn)品都是安全有效、含量和雜質(zhì)限度一致并符合標(biāo)準(zhǔn)。,第三節(jié) 基因工程藥物的檢驗(yàn),一、基因工程藥物常用幾種檢驗(yàn)方法,(一)化學(xué)檢定法 1. Lowry法則定蛋白質(zhì)含量 2.用電泳法(非還原型SDS-PAGE法)測定純度 3.用高效液相色譜(HPLC)法測定純度 4.用電泳法(還原型SDS-PAGE法)測定相對(duì)分子質(zhì)量 5.用等電聚焦電泳法測等電點(diǎn),(二)肽圖分析法,肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶（一般為肽鏈內(nèi)切酶）作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜。 肽圖譜分析是基因工程多肽藥物質(zhì)量控制的重要手段。肽圖譜對(duì)每一種蛋白質(zhì)來說是特征的、專一的。通過肽圖分析可以鑒別蛋白質(zhì)，預(yù)測其一級(jí)結(jié)構(gòu)特征。,(三)外源性DNA殘留量的測定,檢測殘留DNA的方法可采用雜交分析技術(shù)、順序單獨(dú)分析技術(shù)或其他靈敏的分析技術(shù)。,(四)宿主細(xì)胞蛋白雜質(zhì)的檢測,宿主蛋白是基因工程藥物特有的雜質(zhì)，其含量是質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前采用點(diǎn)-免疫結(jié)合法測定。,(五)無菌試驗(yàn) 基因工程藥物和其他生物制品不得含有雜菌，滅活疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造過程中應(yīng)由制造部門按各制品制造及檢定規(guī)程規(guī)定進(jìn)行無菌試驗(yàn)，分裝后的制品須經(jīng)質(zhì)量檢定部門做最后檢定。,(六)內(nèi)毒素試驗(yàn) 基因工程藥物內(nèi)毒素的檢定按照中國生物制品規(guī)程2000年版的規(guī)定進(jìn)行。,(七)異常毒性試驗(yàn) 異常毒性試驗(yàn)是指各制品的特異性毒性試驗(yàn)以外的一般安全試驗(yàn)。目的是通過動(dòng)物試