人羧肽酶A1活性中心的畢赤酵母可溶表達(dá) 作者：易靜，郝曉柯，蘇明權(quán)，岳喬紅，劉家云，張瑞，雷迎峰【關(guān)鍵詞】 人羧肽酶 【Abstract】 AIM: To express the human carboxypeptidase A1 (CPA1) active center protein in soluble form in pichia yeast. METHODS: Human CPA1 active center gene was amplified from pGEXCPA1 recombinant plasmid and subcloned into pPIC9K yeast expression vector. Recombinant vector pPIC9KCPA1 active center was transformed into pichia SMD1168 by electroporation. Positive recombinant yeast strains were screened through nutrition defect and G418 resistance. The integrated multicopy recombinant yeast strains were induced for expression. RESULTS: The yeast recombinant expression vector pPIC9KCPA1 active center was constructed and recombinant yeast strains which integrated over 16 recombinant vector copies were obtained. The human CPA1 active center protein was expressed in soluble form in pichia yeast after screened with G418. CONCLUSION: Human CPA1 active center protein has been expressed successfully in pichia yeast, which will be useful for further research on ADEPT of prospate. 【Keywords】 carboxypeptidase A；active center；pichia; gene expression 【摘要】 目的：應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人羧肽酶A1 (carboxypeptidase A1，CPA1）活性中心蛋白. 方法：從pGEXCPA1重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出CPA1活性中心基因，亞克隆入酵母表達(dá)載體pPIC9K，酵母重組表達(dá)載體pPIC9KCPA1active center電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母SMD1168，并進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選和G418抗性篩選，對(duì)高拷貝整合的重組酵母表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá). 結(jié)果：構(gòu)建得到酵母融合重組表達(dá)載體pPIC9KCPA1active center，經(jīng)G418濃度梯度篩選得到串聯(lián)整合16個(gè)重組表達(dá)載體的重組酵母表達(dá)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)后得到CPA1活性中心蛋白. 結(jié)論：在畢赤酵母中成功表達(dá)了CPA1活性中心，為進(jìn)一步研究CPA1活性中心在抗體導(dǎo)向酶-前體藥物療法中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 羧肽酶類A；活性中心；畢赤酵母；基因表達(dá) 0引言 羧肽酶A（carboxypeptidase A,CPA）是一類水解蛋白和多肽底物C端芳香族或脂肪族氨基酸殘基的消化酶，因其底物的首位字母“A”而得名CPA1 . CPA除用于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)或多肽修飾及食品加工外，還能用于疾病的治療，如在抗體導(dǎo)向酶-前體藥物療法(antibodydirected enzyme prodrug therapy，ADEPT)中，CPA即被用作識(shí)別前藥的專一活化酶2，它特異性切割前藥的特定殘基，使其在腫瘤組織中活化，增加了藥物的特異性，減少了其對(duì)正常組織的毒副作用. 本研究組應(yīng)用人CPA1對(duì)前列腺癌ADEPT療法進(jìn)行了多年研究，已克隆并在大腸桿菌中表達(dá)了CPA1活性中心基因3. 由于原核表達(dá)的局限性影響了CPA1的生物活性. 為了得到結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性更接近人CPA1的蛋白，我們擬采用Pichia酵母真核表達(dá)系統(tǒng)(SMD1168宿主細(xì)胞)分泌表達(dá)人CPA1活性中心蛋白，為人CPA1活性中心蛋白在前列腺癌ADEPT療法中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ). 1材料和方法 11材料畢赤酵母菌SMDI1168(his4，pep4)由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室提供；大腸桿菌DH5和畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K由第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室提供；pGEXCPA1active center重組質(zhì)粒由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科構(gòu)建；限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純，電穿孔儀和蛋白電泳儀購自BioRad公司. 12方法 121引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)4報(bào)道的CPA1活性中心基因序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成，其中正向引物P1的5端引入EcoR I酶切位點(diǎn)，反向引物P2的5端引入Not I酶切位點(diǎn). P1: 5 GGAATTCATGATCGACACGGGCATCCATTC 3； P2：5 AGCGGCCGCTCAAGTGTCCCGGAGCTCGAA 3. 用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系組成：模板0.5 L，引物各12.5 pmol，2.5 mmol/L dNTP 2 L， 10PCR緩沖液2.5 L（含MgCl2），Taq DNA聚合酶0.5 U，再用去離子水補(bǔ)至25 L. 循環(huán)參數(shù)為94 5 min后，94變性0.5 min，55退火0.5 min，72延伸2 min，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)，最后72 延伸7 minPCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果. 122重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定純化PCR產(chǎn)物，用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，所獲片段亞克隆到經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K載體中，得到的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選，陽性克隆送上海生工生物工程公司測(cè)序，鑒定所插入的片段序列及構(gòu)建載體的讀碼框架. 經(jīng)序列分析后，所得正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPIC9KCPA1active center. 123轉(zhuǎn)染畢赤酵母菌約10 g的pPIC9KCPA1active center的質(zhì)粒DNA用BglII酶切線性化，然后用電穿孔法轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞并涂布在缺組氨酸的MD平板(13.4 g/L酵母含氮堿基；20 g/L葡萄糖；410-5 g/L生物素；15 g/L瓊脂)上. pPIC9K質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因，其轉(zhuǎn)染的宿主菌能抗氨基糖甙類抗生素(G418). 采用含不同濃度(054.0 g/L)G418的YEPD平板(10 g/L酵母提取物；2 g/L蛋白胨；2 g/L葡萄糖；20 g/L瓊脂)來篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子. 124PCR檢測(cè)CPA1活性中心基因與畢赤酵母染色體基因組的整合按照Invitrogen公司提供的方法，提取能抗4.0 g/L G418的畢赤酵母菌總DNA，用PCR法檢測(cè)CPA1活性中心基因與畢赤酵母染色體基因組的整合，在相同的條件下,用pPIC9KCPA1active center質(zhì)粒DNA，pPIC9K質(zhì)粒DNA和pPIC9K空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌總DNA作對(duì)照. 125人CPA1活性中心基因的表達(dá)和鑒定挑取抗4.0 g/L G418的陽性克隆接種于100 mL BMGY（134 g/L YNB，410-5 g/L生物素，100 mL/L磷酸緩沖液，10 mL/L甘油）培養(yǎng)液中. 30，250 r/min振搖至菌濃度A600 nm為28. 離心收集菌體棄去BMGY 培養(yǎng)液，換15 mL BMMY （13.4 g/L YNB；410-5 g/L生物素；100 mL/L磷酸緩沖液，10 mL/L甲醇）培養(yǎng)液. 30,250 r/min振搖，開始誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h補(bǔ)充甲醇至終濃度為5 mL/L，于0,24,48,72,96和120 h分別取1 mL上清液，以此來比較在不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)量的高低. 同時(shí)用pPIC9K空質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的畢赤酵母宿主菌SMD1168，在相同條件下誘導(dǎo)表達(dá)作為陰性對(duì)照，用SDSPAGE進(jìn)行測(cè)定. 2結(jié)果 21PCR擴(kuò)增CPA1活性中心基因及重組質(zhì)粒pPIC9KCPA1active center的酶切鑒定PCR擴(kuò)增CPA1活性中心基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)一條約606 bp的特異條帶，與預(yù)期結(jié)果大小相符(圖1). PCR產(chǎn)物克隆入載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞. 隨機(jī)挑取2個(gè)白色菌落，于含適量氨芐青霉素的LB液中培養(yǎng)增菌8 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切后，切出約606 bp片段(圖2). 經(jīng)序列測(cè)定分析，結(jié)果與已知序列相比有兩處堿基不同：第607位是TC轉(zhuǎn)換、第1024位是CT轉(zhuǎn)換，但其所編碼的氨基酸沒發(fā)生改變. 2.2PCR分析CPA1活性中心基因與畢赤酵母（SMD1168）染色體基因組的整合通過G418(0.54.0 g/L)壓力篩選出最高能抗4.0 g/L G418的重組子. 根據(jù)同源重組一個(gè)載體約抵抗025 g/L G418估算，同源重組入同一酵母菌的pPIC9KCPA1active center串聯(lián)拷貝數(shù)最高可達(dá)到l6個(gè). 提取重組子總DNA，通過PCR進(jìn)一步鑒定重組子. CPA1活性中心基因穩(wěn)定整合到畢赤酵母染色體基因組中，同時(shí)用畢赤酵母菌SMDI1168和pPIC9K分別做對(duì)照（圖3）. 23CPA1活性中心基因在畢赤酵母中的表達(dá)取BMMY培養(yǎng)液上清與2上樣緩沖液等體積混勻，100加熱3 min，冷卻后取20 L上樣，做SDSPAGE電泳,同時(shí)用pPIC9K空質(zhì)粒做陰性對(duì)照. 結(jié)果顯示在標(biāo)準(zhǔn)marker Mr 27103左右出現(xiàn)一條表達(dá)條帶，與預(yù)期相符，而陰性對(duì)照無此條帶（圖4）. 經(jīng)薄層掃描儀測(cè)定，表達(dá)蛋白占培養(yǎng)液上清中總蛋白的45%（96 h）. 3討論 畢赤酵母是一種嗜甲醇酵母，是在研究中廣泛應(yīng)用的一種表達(dá)宿主. 它能以甲醇作為唯一的能源和碳源，可以在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長，甲醇能迅速誘導(dǎo)巴氏畢赤酵母合成大量的乙醇氧化酶，催化甲醇被氧化成甲醛和過氧化氫. 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)既具有原核細(xì)胞的可操作性特點(diǎn)，也具有真核細(xì)胞的翻譯后加工能力，可對(duì)重組蛋白進(jìn)行糖基化處理，是重組蛋白的較理想的表達(dá)體系，且宿主細(xì)胞自身分泌蛋白量較少，為樣品的純化提供了方便5. 本次研究我們選用pPIC9K及SMD1168（his4，pep4）畢赤酵母菌作為CPA1活性中心蛋白的表達(dá)系統(tǒng). pPIC9K具有factor分泌信號(hào)肽，能分泌表達(dá)目標(biāo)蛋白，使產(chǎn)物獲得較為方便，載體中引入Tnq03 Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子. SMD1168 (his4，pep4)宿主菌染色體基因組中his4和pep4基因缺失，his4基因缺失使組氨醇脫氫酶合成受阻，代謝途徑在組氨醇向組氨酸轉(zhuǎn)化這一步被阻斷，只能在含有組氨酸的培養(yǎng)基中生長，而pPIC9K表達(dá)載體中含有一段編碼his4篩選基因，因此可在缺組氡酸的MD平板上篩選重組子；pep4是與Scerevisiae蛋白水解酶A同源的基因，pep4缺陷型菌株使表達(dá)蛋白的降解受到抑制，因此表達(dá)的目的蛋白不會(huì)被降解. 依據(jù)以上理論，我們?cè)诮湍副磉_(dá)液上清中獲得了預(yù)期分子質(zhì)量的目的蛋白，但SDSPAGE結(jié)果顯示蛋白條帶濃度不高，因此，在后期的功能實(shí)驗(yàn)中，要對(duì)上清中的蛋白進(jìn)行濃縮處理. 【參考文獻(xiàn)】1 Barrett AJ，Rrawlings ND，Woessner JFHandbook of Proteolytic EnzyineMSan Diego：Academic Press，1998：1318-13352 Joshi L，St Leger RJCloning，expression，and substrate specificity of MeCPA，a zinc carboxypeptidase that is secreted into infected tissues by the fungal entomopathogen Metarhizium anisopliaeJJ Biol Chem，1999，274(14)：9803-98113 岳喬紅，于文彬，郝曉柯，等. 人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表達(dá)J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（23）：2132-2135.4 Wei S，Segura S，Vendrell J，e