實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦內(nèi)HSP 70 與Bcl-2的表達(dá)作者：魏秀娥，時宏娟，榮良群，沈霞 【關(guān)鍵詞】腦出血 摘要:目的探討急性腦出血大鼠腦內(nèi)熱休克蛋白HSP70與凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)變化。方法成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對照組與腦出血組（36只），采用自體血注入方法建立大鼠腦出血模型。免疫組織化學(xué)法檢測HSP70與Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果免疫組化示HSP70與Bcl-2在腦內(nèi)廣泛表達(dá)，模型組HSP70出血后6h出現(xiàn)陽性細(xì)胞表達(dá)，24h有較明顯的表達(dá)，72h陽性細(xì)胞表達(dá)仍在增加;Bcl-2陽性細(xì)胞12h表達(dá)開始增加，48h達(dá)高峰。結(jié)論急性腦出血后大鼠腦內(nèi)HSP70與Bcl-2表達(dá)均增強(qiáng)，二者均以皮質(zhì)和海馬區(qū)表達(dá)為主。 關(guān)鍵詞:腦出血;免疫組織化學(xué);大鼠 Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofHSP70andBcl-2inratbrainafteracuteintracerebralhemorrhage（ICH）.MethodsRatswererandomlydividedintoaNScontrolgroupandamodelgroup（n=36each）.ICHmodelwases-tablishedbyinjecting50lofautologousbloodintothecaudatenucleus.Atsixtimepoints（6h，12h，24h，48h，72hand1wafterintracerebralhemorrhage）theexpressionsofHSP70andBcl-2wereexaminedbyimmunohistochemistry.ResultsItwasfoundthatHSP70andBcl-2wereexpressedextensivelyintheratbrain.HSP70andBcl-2expressionsreachedthepeakat72hand48h，respectively.ConclusionTheexpressionsofHSP70andBcl-2areincreasedaftercerebralhemorrhage.Thechanges，mainlyinthecortexandhippocampus，arerelatedtothedegreeofinjury，thetimeelapsedandthelocationoftheaffectedregion. Keywords:intracerebralhemorrhage;immunohistochemistry;rat 近年來研究表明，細(xì)胞凋亡是出血性腦損傷的重要機(jī)制之一，Bcl-2是一種凋亡抑制基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起到重要作用;而HSP70是一種應(yīng)激保護(hù)蛋白，可抑制應(yīng)激激活蛋白激酶，并發(fā)揮其分子伴侶作用，在線粒體上的HSP70可能通過對變性的細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2加以修復(fù)或防止其被降解，恢復(fù)其凋亡抑制功能1。本實(shí)驗(yàn)擬在探討此兩種蛋白在急性腦出血大鼠腦內(nèi)的表達(dá)變化規(guī)律及二者之間的可能關(guān)系。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1動物健康成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠72只，體重220250g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 1.1.2儀器動物立體定位儀（江灣二型）;100l微量進(jìn)樣器（浙江省醫(yī)用器械廠）;KD1508轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）;OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（日本）。 1.1.3主要試劑與藥品鼠抗Bcl-2單克隆抗體與鼠抗HSP70單克隆抗體（美國SantaCruzBioTech公司產(chǎn)品）;即用型二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（均為北京中山生物科技有限公司產(chǎn)品）;10%水合氯醛、PBS緩沖液及其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。 1.2方法 1.2.1實(shí)驗(yàn)動物分組與處理大鼠隨機(jī)分為對照組（NS組）、模型組（出血組），時間點(diǎn)為6，12，24，48，72h，1周，每時相點(diǎn)各取大鼠6只。 1.2.2模型制備參照Yang等2報道的方法改進(jìn)，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜3確定尾狀核的位置:前囟前0.2mm，矢狀縫向右3.0mm，深6.3mm為注射點(diǎn)。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350mg.kg）腹腔麻醉俯臥位固定于立體定位儀上，頭皮正中消毒后矢狀位切開約1.5cm，暴露前囟點(diǎn)，據(jù)圖譜調(diào)整立體定位儀于注射點(diǎn)（A0.2mm，L3.0mm，V6.3mm），鉆顱打孔（直徑約1mm）將鼠尾置于40水溫浴10min后取出擦干消毒，距離鼠尾末端3cm處剪斷，用微量進(jìn)樣器吸取新鮮血液約50l，迅速插入已鉆好孔內(nèi)，進(jìn)針6.3mm（相當(dāng)于尾狀核位置），注射時間不少于15min，留針10min后緩慢退針，鉆孔用骨蠟封閉，局部碘伏消毒后，縫合切口皮膚。大鼠清醒后無偏癱體征（Longa評分）或血液沿針道反流者棄用。 1.2.3免疫組織化學(xué)造模成功后大鼠分別于各時相點(diǎn)經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉后，經(jīng)升主動脈快速灌注37生理鹽水100ml，然后以250ml固定液（40.01MPBpH7.44%多聚甲醛）灌注固定腦組織，30min內(nèi)灌完，取全腦，去除小腦和腦干，置于上述固定液中后固定24h，繼入20%、30%蔗糖液（4pH7.4），直至組織塊沉底。將固定腦組織放在恒冷切片機(jī)上切取30m厚的連續(xù)冠狀切片，于針道前1mm處向背側(cè)隨機(jī)隔6片取一組鄰片。HSP70、Bcl-2均采用漂染法，所有操作均按北京中山公司即用型二步法檢測試劑盒說明書進(jìn)行，腦組織切片用2%H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶，依次加入一抗（HSP701150、Bcl-21100），二抗試劑盒，各步間以0.01mol.LPBS緩沖液振洗，DAB充分顯色5min，常規(guī)脫色、透明、封片。以PBS代替一抗做陰性對照。所有結(jié)果在10，20，40倍目鏡下觀察，采用40倍目鏡計數(shù)每張腦片4個視野，1只大鼠測2張腦片，獲得8個數(shù)值，取其均數(shù)為1只大鼠的最終結(jié)果。 1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以xs表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)。 2結(jié)果 2.1血腫形態(tài)觀察肉眼見出血位于右側(cè)基底節(jié)區(qū)，出血灶直徑約34mm，說明造模成功，術(shù)后24h見術(shù)側(cè)腦彌漫性腫脹，術(shù)后第3天血腫有所吸收，術(shù)后第7天明顯吸收（圖1）。 圖1大鼠腦出血后血腫形態(tài)觀察（略） 2.2陽性細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn) 2.2.1形態(tài)學(xué)觀察各組大鼠腦組織HSP70與Bcl-2陽性細(xì)胞染色均以胞質(zhì)有棕黃色物質(zhì)沉積為主，并可顯示細(xì)胞輪廓。見圖2。 圖2出血側(cè)大鼠腦組織皮質(zhì)48h陽性細(xì)胞表達(dá)（400）（略） A.HSP70陽性細(xì)胞B.Bcl-2陽性細(xì)胞 2.2.2表達(dá)時相與部位對照組HSP70偶有表達(dá)，模型組以造模后6h出現(xiàn)陽性細(xì)胞表達(dá)，術(shù)后24h有較明顯的表達(dá)，術(shù)后72h最為顯著;而Bcl-2在造模后12h出現(xiàn)陽性細(xì)胞，48h達(dá)高峰。HSP70在腦內(nèi)廣泛表達(dá)，主要見于海馬、紋狀體和皮質(zhì)中;Bcl-2陽性神經(jīng)元集中于出血側(cè)皮質(zhì)、海馬CA1、CA2區(qū)及基底節(jié)區(qū);二者在血腫區(qū)幾乎未見陽性細(xì)胞表達(dá)。 2.2.3陽性細(xì)胞表達(dá)的量見表1，2。 表1各組各時相點(diǎn)血腫周圍皮質(zhì)HSP70陽性細(xì)胞數(shù)（略） 生理鹽水組各時相點(diǎn)均見少量陽性細(xì)胞表達(dá)，組內(nèi)比較:P>0.05;與同時相點(diǎn)生理鹽水組比較:P<0.05 表2各組各時相點(diǎn)出血側(cè)皮質(zhì)Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)（略） 生理鹽水組各時相點(diǎn)均見少量陽性細(xì)胞表達(dá)，組內(nèi)比較:P>0.05;腦出血組與同時相點(diǎn)生理鹽水組比較:P<0.05 3討論 了解腦內(nèi)出血后腦損傷的發(fā)展對于確定治療方案是很重要的。實(shí)驗(yàn)研究表明，腦內(nèi)血腫周圍及其遠(yuǎn)隔區(qū)域存在缺血，直至全腦的廣泛損害4。HSP70是生物細(xì)胞在各種應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生熱休克反應(yīng)所合成的熱休克蛋白，其主要生物學(xué)功能是起分子伴侶作用，正常腦組織中含量較少。在腦出血時，第1天即出現(xiàn)HSP70表達(dá)，至少持續(xù)5天，主要表達(dá)部位在血腫周圍5，6，以神經(jīng)細(xì)胞為主。本實(shí)驗(yàn)研究表明，生理鹽水組可有少量陽性細(xì)胞表達(dá)，各時相點(diǎn)無明顯差別，而腦出血后6h出現(xiàn)陽性細(xì)胞表達(dá)，24h見大量表達(dá)，4872h達(dá)高峰，7天時仍見表達(dá)。此與血腫壓迫致缺血半暗帶形成，誘發(fā)HSP70的表達(dá)，從而對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用有關(guān)。 Bcl-2是一種原癌基因，為抗凋亡基因，具有促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，位于凋亡調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵部位7，可抑制細(xì)胞程序化死亡（PCD）。本實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠腦出血后6h偶見陽性細(xì)胞表達(dá)，48h達(dá)高峰，Bcl-2的這種變化可能是神經(jīng)自我保護(hù)機(jī)制之一。與其在腦出血損傷時抑制氧自由基、阻止促凋亡基因信號傳遞、抑制Ca2+的釋放等有關(guān)。 既往研究表明，在線粒體參與的胞質(zhì)程序化死亡的途徑中，表達(dá)在線粒體上的HSP70可能通過對變性的細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2加以修復(fù)或防止其被降解，恢復(fù)其凋亡抑制功能。本實(shí)驗(yàn)中，在腦出血術(shù)后第1天，HSP70、Bcl-2的表達(dá)均增高，第3天達(dá)到高峰，至第7天減少，與腦組織在第3天損害嚴(yán)重的變化規(guī)律一致。結(jié)合既往的研究:二者均在線粒體上有表達(dá)、均有抗氧化損傷作用、對一些調(diào)亡刺激因子引起的細(xì)胞調(diào)亡均有抑制作用等，綜合以上資料，二者在腦出血抗凋亡作用中似存有協(xié)同作用，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。 參考文獻(xiàn): 1SamaliA，CotterTG.Heatshockproteinsincreaseresistancetoapop-tesisJ.ExpCellRes，1996，223（1）:163-170. 2YangGY，BetxAL，ChenevertTL，etal.Experimentalintracerebralhemorrhage:relationshipbetweenbrainedema，bloodflow，andblood-brainbarrierpermeabilityinratsJ.JNeurosurg，1994，81（1）:93-102. 3包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜M.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:35. 4MatsushitaK，MengW，WangX，etal.EvidenceforapoptosisafterintracerebralhemorrhageinratstriatumJ.JCerebBloodFlowMetab，2000，20（2）:396-404. 5MatxPG，SundaresanS，SharpFR，etal.InductionofHSP70inratbrainfollowingsubarachnoidhemorrhageproducedbyendovascularper-forationJ.JNeurosurg，1996，85（1）:138-145. 6MatzPG，WeinsteinPR，SharpFR.Hemeoxyge