糖尿病早期大鼠背根神經(jīng)節(jié)IGF-I與GAP-43 mRNA的表達【摘要】 目的：觀察糖尿病早期（2周）大鼠背根神經(jīng)節(jié)中胰島素樣生長因子-I （IGF-I）與生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）基因的表達變化以及胰島素對其的影響。方法：按60mg/kg予SD大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素制備胰島素依賴性糖尿病大鼠模型，然后將造模成功的大鼠隨機分成模型組與治療組，治療組于造模成功后第2天開始皮下注射胰島素進行治療，qd。2周后取各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG），Trizol法提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR法測定IGF-I與GAP-43 mRNA的表達。結(jié)果：在糖尿病早期大鼠DRG中，IGF-I，GAP-43 mRNA的表達顯著下調(diào),胰島素能明顯上調(diào)IGF-I mRNA的表達，對GAP-43 mRNA的表達有上調(diào)趨勢。結(jié)論：在早期糖尿病DRG中IGF-I，GAP-43 mRNA表達下調(diào)，參與了糖尿病外周神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展。 【關(guān)鍵詞】 糖尿病 胰島素樣生長因子-I 生長相關(guān)蛋白-43 背根神經(jīng)節(jié) 大鼠 Abstract Objective: To observe the changes of expression of IGF-I and GAP-43 mRNA in rat dorsal root ganglion of early diabetes and effect of insulin treatment on them. Methods: Insulin-dependent diabetes mellitus model were induced with a single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ, 60mg/kg). After model was made successfully, the diabetic model rats were divided into two groups (the diabetic model group and the insulin treatment group). In the second day, the insulin treatment group was injected subcutaneously with protamine zinc insulin once a day. The administration was ceased on the end of the second week, then the dorsal root ganglion of rats in each group were isolated and the total RNA was extracted by using Trizol reagent and the IGF-I and GAP-43 gene expression were detected by the method of RT-PCR. Results: The levels of IGF-I and GAP-43 mRNA were decreased obviously in early diabetic DRG (P<0.01), and insulin treatment could up-regulate the gene expression of IGF-I significantly (P<0.01) and had the tendency of increasing GAP-43 expression. Conclusion: The reductions of IGF-I and GAP-43 mRNA in DRG of early phase of diabetes may contribute to the pathogenesis of diabetic peripheral neuropathy. Key words Diabetes mellitus; IGF-I; GAP-43; Gene expression; Dorsal root ganglion; Rat 糖尿病外周神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病（DM）最常見的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病患者致死致殘的主要因素。其發(fā)病機制未完全清楚，目前認為它與血管障礙、代謝紊亂以及神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等因素有關(guān)。胰島素樣生長因子-I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對感覺、運動及植物神經(jīng)具有營養(yǎng)作用，能促進神經(jīng)的生長和修復(fù)，而生長相關(guān)蛋白43（growth associated proteim-43，GAP-43）被認為是神經(jīng)生長的重要標(biāo)志物，在神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生中起著非常重要的作用。相關(guān)文獻報道，糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生可能與IGF-I水平下降有關(guān)，與GAP-43水平的變化也有一定關(guān)系1，2。由于感覺異常往往是DPN的首發(fā)癥狀，在糖尿病狀態(tài)下，背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）作為初級感覺神經(jīng)元容易受損。糖尿病早期感覺神經(jīng)元中IGF-I與GAP-43基因表達水平的變化如何，對于揭示DPN發(fā)病機制具有重要意義，但目前尚無相關(guān)文獻報道。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)觀察糖尿病早期（2周）大鼠DRG中IGF-I與GAP-43基因的表達變化以及胰島素對其的影響，從而探討糖尿病早期神經(jīng)病變發(fā)生的分子機制。 1 材料與方法 1.1 藥品與試劑 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司），精蛋白鋅胰島素注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司），TRIzol Reagent（上海生工公司）。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(dT)與dNTP（美國Promega公司）。DNA酶（Worthington公司原裝）。Taq（加拿大BBI公司產(chǎn)品），DL-2000 DNA Marker（TaKaRa公司產(chǎn)品）。 1.2 模型制備 雄性SD大鼠30只,體重180220g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供, 禁食12h后,從中隨機取22只大鼠，按60mg/kg體重給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素進行造模，余8只作為正常對照組，同時給予腹腔注射等體積的檸檬酸鹽緩沖液。72h后,從大鼠尾靜脈取血，鄰甲苯胺法測定血糖,以非空腹血糖>16.0mmol/L視為糖尿病模型大鼠。最后成模大鼠為16只。 1.3 實驗分組 將實驗動物分為3組:正常對照組（8只）、模型動物按血糖高低隨機分為模型組和治療組（各8只）。治療組在糖尿病模型造模成功后第2天開始每天皮下注射精蛋白鋅胰島素注射液(長效胰島素,40U/ml),胰島素用量根據(jù)血糖值調(diào)整,使大鼠非空腹血糖在3.910mmol/L之間，一般胰島素用量為46U/d，造模成功后2周末時停止給藥。正常對照組、模型組大鼠同時給予皮下注射相同容積的生理鹽水。 1.4 大鼠背根神經(jīng)節(jié)RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄(RT) (1)提取總RNA:造模2周末時用TRIzol試劑按常規(guī)分別提取正常、模型與治療組大鼠DRG的總RNA,測OD260、OD280值,計算RNA的濃度?？俁NA用無RNA酶的DNaseI處理。并對總RNA進行甲醛變性膠電泳，檢測其完整性。(2)合成cDNA第一鏈:參照Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進行,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系25l:2g RNA(0.54l),1l Oligo(dT)15(0.5g/l),加入DEPC-treated水至12l,70 5min后驟冷,然后加入5l M-MLV 5Reaction Buffer,5l dNTPs，1l M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/l),加DEPC-treated水至25l,37 60min,然后70 10min停止反應(yīng)。 1.5 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中提供的IGF-I、GAP-43和-actin基因(-肌動蛋白，管家基因)的全長cDNA序列,通過Primer3設(shè)計，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成IGF-I、GAP-43和-actin引物。見表1。 分別對治療組、模型組與對照組的cDNA進行PCR擴增，以-actin作為內(nèi)參。25l反應(yīng)體系內(nèi)包含cDNA 1l,10PCR Buffer 2l,上下游引物各10pmol,MgCl2 1.5mmol/L,dNTP各0.15mmol/L,TaqDNA聚合酶2U。使用PTC-100PCR儀(美國MJ.RESEARCH.INC.)進行擴增。IGFI與GAP-43基因的擴增條件為：94 4min，94 35s57 30s72 30s,循環(huán)29次后，于72 延伸7min，每管適時加入內(nèi)參-actin引物，內(nèi)參擴增25次。PCR產(chǎn)物在含溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠上電泳分離。將凝膠置暗箱，使用小源凝膠分析系統(tǒng)拍照，獲得凝膠電泳圖像，使用Scion Image圖像分析軟件進行PCR產(chǎn)物條帶分析。 1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 為減少誤差，以目的基因與內(nèi)參的比值代替目的基因進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用s表示，使用單因素方差分析,兩兩比較使用Scheffe檢驗統(tǒng)計，P0.01示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 總RNA質(zhì)量鑒定 OD260/OD280比值均在1.82.0之間,符合純度要求?？俁NA電泳檢測結(jié)果顯示RNA分子完整，無降解。如圖1。 2.2 大鼠背根神經(jīng)節(jié)IGF-I與GAP-43 mRNA表達 總RNA經(jīng)RT-PCR后,于2%瓊脂糖膠上電泳,結(jié)果見圖2、3。結(jié)果見圖2，3。將PCR產(chǎn)物條帶進行掃描統(tǒng)計分析顯示，IGF-I mRNA在對照組中相對表達量為0.690.06，在模型組中為0.360.11，在胰島素治療組中為0.610.12，GAP-43 mRNA在對照組中相對表達量為1.800.28，在模型組中為0.640.15，在治療組中為0.910.18，對其進行統(tǒng)計分析，可見IGF-I和GAP-43 mRNA在糖尿病早期模型組大鼠DRG中的表達明顯下調(diào)（P<0.01）,胰島素治療后能明顯上調(diào)IGF-I的表達（P<0.01），對GAP-43的表達有上調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。 3 討 論 IGFs即胰島素樣生長因子，近年研究發(fā)現(xiàn)其對感覺、運動及植物神經(jīng)具有營養(yǎng)作用。IGFs包括IGF-I與IGF-。糖尿病的動物實驗與臨床實驗均顯示IGFs的表達水平降低。Ishii提出了關(guān)于糖尿病神經(jīng)病變發(fā)病機制的假說：因胰島素、IGF或IGF結(jié)合蛋白（IGFBP）、IGF受體及受體后的原因引起胰島素、IGF作用降低，引起神經(jīng)的營養(yǎng)支持減少導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生1。已有相關(guān)文獻報道，IGFs mRNA在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的外周神經(jīng)、脊髓、肝臟及腎上腺中都顯著減少2，而在早期糖尿病的感覺神經(jīng)元中的IGFs的水平是否與其它組織中的表達一致，尚無相關(guān)文獻報道。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-I mRNA在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病早期大鼠DRG中顯著下調(diào)（P<0.01），而Craner3報道鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM大鼠7周后，免疫細胞化學(xué)法顯示小直徑的DRG神經(jīng)元中IGF-I蛋白水平顯著下降。這說明糖尿病早期DRG即有IGF-I mRNA水平的顯著下降，導(dǎo)致IGF-I的蛋白水平也隨之下降。胰島素治療后能明顯逆轉(zhuǎn)IGF-I在糖尿病早期大鼠DRG中的表達變化（P<0.01），這提示，IGF-I表達下調(diào)不是由于鏈脲佐菌素毒性直接導(dǎo)致的，與胰島受損也沒有直接關(guān)聯(lián)，推測可能與體內(nèi)胰島素降低、高血糖及由此引發(fā)的糖代謝紊亂或神經(jīng)組織缺血缺氧有關(guān)。胰島素可直接作用或通過控制血糖，減輕神經(jīng)組織代謝紊亂或缺血缺氧來上調(diào)IGF-I的表達。 GAP-43即生長相關(guān)蛋白43（又名B50，F(xiàn)1，神經(jīng)調(diào)素），在80年代初，發(fā)現(xiàn)它與神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建密切相關(guān)，被認為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的一個內(nèi)在決定因子。有研究顯示，在外周神經(jīng)受損時，其受損神經(jīng)與再生神經(jīng)元中的GAP-43 mRNA水平都顯著升高4，5,說明GAP-43在神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生中扮演極其重要的角色。而在DM狀態(tài)下，其神經(jīng)再生能力存在著缺陷，研究顯示DM大鼠外周神經(jīng)損傷后，其受損神經(jīng)以及DRG中的GAP-43的表達均不能反應(yīng)性上調(diào)，這可能是其神經(jīng)軸突再生較緩慢的原因之一6，7。在糖尿病基礎(chǔ)狀態(tài)下，早期感覺神經(jīng)元中的GAP-43的表達變化如何，尚無相關(guān)文獻報道。實驗發(fā)現(xiàn)在糖尿病早期（2周）大鼠DRG中GAP-43 mRNA的表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而胰島素有上調(diào)其表達趨勢。 本研究結(jié)果提示，在糖尿病早期，一方面，由于DRG中IGF-I水平下降，感覺神經(jīng)元的營養(yǎng)支持減少，并由于神經(jīng)內(nèi)膜血流量的減少8，神經(jīng)組織存在缺血損傷，致使感覺神經(jīng)功能受損，而另一方面，作為神經(jīng)元生長發(fā)育、神經(jīng)再生的標(biāo)志物GAP-43在感覺神經(jīng)元中表達低下，這就可能導(dǎo)致受損神經(jīng)不能有效地進行自我修復(fù)與再生，從而促進了糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生?！緟⒖嘉墨I】 1 Ishii DN. Implication of insulin-like growth factors in the pathogenesis of diabetic neuropathyJ. Brain Res Brain Res Rev, 1995, 20(1):47-67.2 Ishii DN, Guertin DM, Whalen LR. Reduced insulin-like growth factor-I mRNA content in liver, adrenal glands and spinal cord of diabetic ratsJ. Diabetologia, 1994, 37(11):1073-1081.3 Craner MJ, Klein JP, Black JA, et al. Preferential expression of IGF-I in small DRG neurons and down-regulation following injuryJ. Neuroreport, 2002, 13(13):1649-1652.4 丁 斐,崔學(xué)芝,顧曉松. 生長相關(guān)蛋白及其mRNA