轉(zhuǎn)移抑制基因MKK4在大腸癌中的表達(dá)與其生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系 作者：王菊芳，何常，陳志英，李珀，鐘愉【摘要】 目的： 檢測有絲分裂素激活蛋白激酶激酶4（Mitogenactivated protein Kinase Kinase 4，MKK4)在大腸癌中的表達(dá)與其生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系。方法： 應(yīng)用免疫組織化學(xué)Envision二步法對58例大腸癌和20例大腸黏膜慢性炎癥MKK4表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果： 大腸癌組織中MKK4陽性表達(dá)率為75.9 %,慢性炎癥組織中MKK4陽性表達(dá)率為100 %，大腸癌MKK4陽性表達(dá)率較慢性炎癥組織低，差異有顯著性（P<0.05）；大腸癌組織中MKK4陽性表達(dá)率與患者年齡、性別、腫瘤部位及大小無關(guān)（P>0.05），與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、浸潤深度及生存期有關(guān)（P<0.05）。結(jié)論: MKK4可能在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)展過程中具有重要作用，與患者預(yù)后相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 基因 腫瘤抑制 癌 大腸 有絲分裂素激活蛋白激酶激酶類 病理學(xué) 臨床 預(yù)后Abstract Objective: To investigate the expression of mitogenactivated protein kinase kinase 4（MKK4）in colorectal carcinoma and its relationship with the biological behavior and prognosis of the tumor. Methods: MKK4 expression in tissue specimens of 58 cases of colorectal carcinoma and 20 cases of chronic inflammatory were detected by using immunohistochemistry (IHC) method, and Envision twostep staining method. Results: Positive rate of MKK4 protein in colorectal carcinoma tissues ( 75.9 %) was lower than that in chronic inflammatory tissues (100 %). The difference was significant (P<0.05). MKK4 expressions in carcinoma tissues correlated with lymph node metastasis（P<0.05）, Dukes stage（P<0.05）, invasive depth (P<0.05), and survival time(P<0.05), but not with age, gender, location or tumor volume (P>0.05). Conclusions： MKK4 may play an important role in the progression , metastasis of human colorectal carcinoma，and closely correlates with patients prognosis.Key words genes, tumor suppressor; carcinoma; intestine, large; mitogenactivated protein kinase kinases; Pathology, clinical; prognosis轉(zhuǎn)移是腫瘤的主要惡性表型，嚴(yán)重影響腫瘤患者治療的療效和預(yù)后，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的發(fā)現(xiàn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷和干預(yù)治療提供重要線索。轉(zhuǎn)移抑制基因的功能是當(dāng)前研究的熱點,它們之間一個共同的主題是參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路1。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因MKK4/MAP2K4/JNKK1/SEK1(Mitogenactivated protein Kinase Kinase 4/ cJun NH2terminal Kinaseactivating Kinase1/Stressactivated protein/Erk Kinase 1，MKK4)是應(yīng)激激活蛋白激酶信號級聯(lián)反應(yīng)通路的一員，通過直接激活和（或）磷酸化下游信號，最終調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活化，介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞的生長、分化、存活和凋亡。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因MKK4不同于腫瘤抑制基因，它抑制轉(zhuǎn)移的發(fā)展而不影響原發(fā)腫瘤的生長。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌中MKK4 mRNA與MMP9 mRNA的表達(dá)有一定相關(guān)性，二者的表達(dá)改變與原發(fā)性肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系2。有關(guān)MKK4介導(dǎo)的JNK/P38通路活化與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制關(guān)系的研究已經(jīng)很全面,包括在卵巢癌3、前列腺癌4,5、胰腺癌6和肺癌7的發(fā)展過程中可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，MKK4的純合子缺失或表達(dá)降低也許促成了卵巢漿液性癌的發(fā)展8，MKK4在人類大腸癌中的研究尚未見到，本文探討大腸癌中MKK4蛋白表達(dá)及其對大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的影響。1 材料和方法 1.1 實驗材料收集1994-1998年確診，并保存有完整臨床和隨訪資料的大腸癌標(biāo)本58例，所有標(biāo)本均為10 %中性福爾馬林固定、石蠟包埋，均為管狀腺癌II級。其中，男性28例，女性30例；年齡2575歲，平均55.76歲；< 50歲18例，50歲40例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；生存期<5年30例，>5年28例。收集同期20例大腸黏膜慢性炎癥作為對照。1.2 主要試劑MKK4抗體（兔單抗IgG,目錄號AB33904）購自深圳市基因谷科技有限公司，PV-9000通用型免疫組化試劑盒、EDTA（PH8.0）抗原修復(fù)液和DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.3 實驗方法免疫組織化學(xué)Envision二步法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。每次實驗均設(shè)置已知乳腺癌切片作陽性對照，PBS代替第一抗體作陰性對照。1.4 結(jié)果判定通過雙盲法由兩位有經(jīng)驗的病理專家獨立評估。每張染色切片隨機(jī)選取10個染色均勻的高倍視野（400），每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。10個視野陽性細(xì)胞平均百分率被認(rèn)為是陽性細(xì)胞百分率；沒有陽性細(xì)胞賦值為0，30以下為1，3170為2，70為3。染色標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)每張切片的大多數(shù)細(xì)胞染色特征決定，沒有染色賦值為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3。最終結(jié)果由染色的總數(shù)和染色強(qiáng)度共同決定，總值0表示陰性，02為弱陽性，24為中等陽性，46為強(qiáng)陽性，2為低表達(dá)，>2為高表達(dá)。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 計數(shù)資料用2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 MKK4表達(dá)MKK4的表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿中，呈棕黃色，胞核中也有少量表達(dá)（圖1）。MKK4在大腸癌組織中陽性表達(dá)率為75.9，慢性炎癥組織中陽性表達(dá)率為100，兩組有顯著差異（P<0.05），見表1。表1 MKK4在大腸癌及大腸黏膜慢性炎癥組織中的表達(dá)（略）注：2=4.36,P0.05。2.2 MKK4在大腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 MKK4的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置無明顯相關(guān)（P>0.05）；與腫瘤的Dukes分期、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期有關(guān)（P<0.05）。見表2。表2 MKK4在大腸癌的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（略）3 討論 癌癥轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞的復(fù)雜運動過程，起始于細(xì)胞從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散，終止于在第二位點形成轉(zhuǎn)移灶。轉(zhuǎn)移的形成需要一系列不連續(xù)事件，通常指轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)，即惡性細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落，通過血流和淋巴管運輸，在第二位點定位、存活并長成可見團(tuán)塊的一個過程。MKK4和轉(zhuǎn)移抑制關(guān)系的研究是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)移研究的結(jié)合。Hyung L等5檢測表明在正常前列腺上皮組織中MKK4高表達(dá)，腫瘤組織中MKK4的表達(dá)與Gleason分級（前列腺癌轉(zhuǎn)移傾向的預(yù)測指標(biāo)）呈負(fù)相關(guān)，有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，證實MKK4蛋白在前列腺癌發(fā)展過程中連續(xù)下調(diào)，并且支持它的信號級聯(lián)反應(yīng)失調(diào)在臨床疾病中的作用。Wei Xin等6在根治的原發(fā)浸潤性胰腺癌標(biāo)本和轉(zhuǎn)移性胰腺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)MKK4免疫標(biāo)記缺失有著更短生存期的趨勢，MKK4陽性的癌癥死亡風(fēng)險是陰性的一半，在胰腺癌MKK4蛋白表達(dá)缺失也許比基因失活更常見，并且MKK4缺失也許與疾病進(jìn)展有關(guān)。Donald J等7研究表明MKK4的激酶活性對抑制明顯轉(zhuǎn)移是必須的，對延長AT6.1鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移模型動物的生存期是有效的，MKK4通過抑制擴(kuò)散癌細(xì)胞侵襲肺（第二位點）的能力而抑制明顯轉(zhuǎn)移的形成；并發(fā)現(xiàn)肺擴(kuò)散癌細(xì)胞中的MKK4有活性而原發(fā)腫瘤中的沒有，這給為什么MKK4特異性抑制轉(zhuǎn)移而不影響原發(fā)腫瘤提供了生化解釋。 本研究運用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測MKK4蛋白在大腸癌和大腸慢性炎癥中的表達(dá)，結(jié)果顯示MKK4的表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)，與臨床分期、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有關(guān)。Dukes C+D期、腫瘤浸潤至漿膜外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期5年的大腸癌中MKK4低表達(dá)，MKK4可能在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)展過程中起重要作用，與患者預(yù)后密切相關(guān)。提示MKK4信號級聯(lián)反應(yīng)的中斷和下調(diào)，對臨床判斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為和預(yù)后有一定實用意義。但是，MKK4在腫瘤中的作用也有不一致的報道。Lei Wang等9發(fā)現(xiàn)MKK4在乳腺癌中是原癌基因而不是抑癌基因，Wu C等10報道胃癌中MKK4表達(dá)更低的病人明顯有著更長的無病存活期和總生存期。因此，MKK4在正常和惡性組織中表達(dá)潛在的器官特異性區(qū)別有待于進(jìn)一步研究。 大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移能力的獲得最終導(dǎo)致臨床不可治愈，而大多數(shù)臨床和基礎(chǔ)研究集中在癌癥局限和可治愈時的檢測和治療上。與此同時，臨床和實驗數(shù)據(jù)的收集證實了癌細(xì)胞擴(kuò)散到第二位點發(fā)生得更早更頻繁。對轉(zhuǎn)移抑制基因功能和行為的研究也許能夠找到癌癥治療的新方法。據(jù)推測，信號級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控轉(zhuǎn)移抑制，將給抗轉(zhuǎn)移治療提供目標(biāo)，這個目標(biāo)的達(dá)到需要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的聯(lián)合努力?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Kauffman EC,Robinson VL,Stadler WM，et al.Metastasis suppression:the evolving role of metastasis suppressor genes for regulating cancer cell growth at the secondary siteJ.J Urol,2003(3):1122-1133.2李明意,姚金科,周小華，等. MKK4、MMP9基因的表達(dá)與原發(fā)性肝癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系J.中國病理生理雜志,2006(8):1480-1483.3Jonathan A Hickson, Dezheng Huo, Donald J Vander Griend，et al. The p38 kinases MKK4 and MKK6 suppress metastatic colonization in human ovarian carcinomaJ. Cancer Res,2006(66):2264-2270.4Yoshida BA, Dubauskas Z, Chekmareva MA, et al. Mitogenactivated protein kinase kinase4/stressactivated protein/Erk kinase1 MKK4/SEK1, a prostate cancer metastasis suppressor gene coded by human chromosome17J. Cancer Res, 1999(21):5483-5487.5Hyung L Kim, Donald J，Vander Griend ,et al. Mitogenactivated protein kinase kinase 4 metastasis suppressor gene expression is inversely related to histological pattern in advancing human prostatic cancersJ.Cancer Res,2001(61):2833-2837.6Xin W, Yun KJ, Ricci F, et al.MAP2K4/MKK4 expression in pancreatic cancer: genetic validation of immunohistochemistry and relationship to disease courseJ. Clin Cancer Res,2004(24):8516-8520. 7Donald J，Vander Griend ,Masha Koche