目錄摘要1Abstract2第一章 緒論31.1研究背景31.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及研究意義31.3 研究內(nèi)容5第二章 Shewanella puterfaciens CN32及測試指標(biāo)標(biāo)線52.1 CN32菌準(zhǔn)備52.1.1 收菌方法52.1.2測收菌后OD值62.1.3接菌62.2鐵標(biāo)線62.3菌體生長標(biāo)準(zhǔn)曲線72.4 SMP蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線8第三章 不同鐵源及電材料對Fe(III)的還原效果的影響93.1引言93.2材料與方法103.2.1 培養(yǎng)基準(zhǔn)備103.2.2 實(shí)驗(yàn)材料113.2.3儀器123.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)123.3.1 數(shù)據(jù)處理133.3.2 測定周期133.4實(shí)驗(yàn)分析方法133.4.1分析指標(biāo)133.4.2 Fe(II)濃度133.4.3黃素143.5 結(jié)果與討論143.5.1 針鐵礦及電材料對Fe(III)的還原效果的影響143.5.1.1 溶解態(tài)Fe(II)143.5.2 NTA-Fe及電材料對Fe(III)的還原效果的影響193.5.2.1 溶解態(tài)Fe(II)193.6 本章小結(jié)24第四章 不同條件下細(xì)菌分泌蛋白的差異264.1引言264.2材料與方法264.2.1 培養(yǎng)基準(zhǔn)備264.2.2 實(shí)驗(yàn)材料274.2.3儀器274.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)284.3.1 數(shù)據(jù)處理294.3.2 測定周期294.4 實(shí)驗(yàn)分析294.4.1分析指標(biāo)294.4.2菌體生長情況294.4.3分泌蛋白濃度304.5結(jié)果與討論304.5.1 菌體生長304.5.2 細(xì)菌分泌蛋白32第五章結(jié)論與展望345.1結(jié)論345.2展望34第六章 致謝35不同鐵源及導(dǎo)電材料的添加對Shewanlla puterfaciens CN32鐵還原過程的影響摘 要：異化鐵還原菌還原Fe(III)是鐵循環(huán)及能量流動(dòng)的重要環(huán)節(jié)，在微生物的氧化還原反應(yīng)中，鐵氧化物充當(dāng)電子載體，能夠有效的加快微生物對有機(jī)物的降解。有研究表明通過補(bǔ)充外源微量元素可以有效提高厭氧微生物活性，鐵元素便是外來元素之一。在自然界中有很多細(xì)菌可以通過還原礦物中的高價(jià)鐵以獲取能量，其中奧奈達(dá)湖希瓦氏菌Shewanella oneidensis是研究最多的異化鐵還原菌之一。所以本文以Shewanella puterfaciens CN32為微生物，研究的內(nèi)容包括：1.考察了添加導(dǎo)電材料對Fe(III)還原效果的影響，結(jié)果顯示：以針鐵礦為鐵源時(shí)，添加石墨及CNTs對Fe(III)還原有抑制作用。以NTA-Fe為鐵源時(shí)，添加石墨及CNTs能夠刺激Fe(III)還原。2.考察了不同鐵源下對Fe(III)還原效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明游離態(tài)NTA-Fe的Fe(III)還原效果較固定態(tài)針鐵礦的還原效果好。3.考察了不同的條件下細(xì)菌分泌蛋白的差異，結(jié)果表明添加石墨對分泌蛋白有促進(jìn)作用，添加CNTs對分泌蛋白有抑制作用。關(guān)鍵詞：Shewanella puterfaciens CN32；Fe(III)還原；不同鐵源；導(dǎo)電材料；分泌蛋白The impact of adding different types of iron and conductive material on Shewanlla puterfaciens CN32 iron reductionAbstract：Bacteria reduction of iron oxide Fe (III) is an important part of iron circulation and energy flow in the oxidation-reduction reaction of microorganisms, the iron oxide acts as an electron carrier, can effectively accelerate the microbial degradation of organic matter.it is shown that by supplementing exogenous trace elements can effectively improve the anaerobic microbial activity, iron is one of foreign elements.There are many bacteria by reduction of ferric minerals for energy in nature, where the Oneida Lake Shewanella Shewanella oneidensis is one of the most studied alienation iron-reducing bacteria.So this paper use Shewanella putrefaciens CN32 as microorganisms, the study include:1.The effect of adding a conductive material to Fe (III) reduction effect, the results show: the goethite iron source, adding graphite and CNTs to Fe (III) reduction of inhibition. In NTA-Fe is iron source, adding graphite and CNTs can stimulate the Fe (III) reduction.2.The effects of different iron sources under on Fe (III) reduction effect, the experimental results show that the free state NTA-Fe of Fe (III) reduction effect than the reduction effect of fixed goethite good.3.The effects of differences in bacterial secreted proteins under different conditions, the results showed that addition of graphite can promote secretion of the protein, adding CNTs to inhibit the secretion of the protein.Keywords:Shewanella puterfaciens CN32;Fe (III) reduction;secreted proteins; different iron source; a conductive material第一章 緒論1.1研究背景 在土壤、沉積物及淺埋藏的環(huán)境中，存在著豐富的鐵的氧化物（如水鐵礦、赤鐵礦及針鐵礦等）1,2，這些鐵的氧化物是地球表層中最重要的鐵資源。控制了地表系統(tǒng)中的Fe(II)-Fe(III)的氧化還原就等于掌握了鐵循環(huán)過程及能量流動(dòng)的重要環(huán)節(jié)3.4，其中含鐵礦物的微生物氧化-還原作用越來越受到人們的關(guān)注4，5 。部分異養(yǎng)厭氧型微生物在進(jìn)行呼吸作用的同時(shí)還可以通過還原 Fe(III)來獲得能量，這種鐵的異化還原能力在許多生物、地球及化學(xué)循環(huán)中都起著舉足輕重作用6-10，也能顯著影響重金屬污染的生物修復(fù)、金屬腐蝕的控制及生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化等11-14 。所以，F(xiàn)e(III)的還原是鐵的生物、地球及化學(xué)循環(huán)過程的重要環(huán)節(jié)。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了自然界中有許多細(xì)菌可以通過還原礦物中的高價(jià)鐵以獲取能量 4 ，其中奧奈達(dá)湖希瓦氏菌Shewanella oneidensis是研究最多的異化鐵還原菌之一15-19 。Shewanella屬常見于土壤、沉積物、地表水和地下水，為革蘭氏陰性異化金屬還原菌，能利用氧氣、高價(jià)金屬以及變價(jià)無機(jī)鹽類作為終端電子受體，獲取生長所需能量 20-23。從細(xì)菌與針鐵礦反應(yīng)過程的研究中顯示，在厭氧環(huán)境下 Shewanella puterfaciens在針鐵礦表面的吸附遠(yuǎn)強(qiáng)于有氧條件，并且由于細(xì)菌表面的還原酶多，可促進(jìn)電子由細(xì)菌向礦物的表面有效轉(zhuǎn)移 24,25。對比針鐵礦與 +3 價(jià)游離鐵離子的微生物還原作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌易于直接還原游離態(tài)的Fe 3+ 離子，而結(jié)晶態(tài)鐵礦物的溶解還原則相對比較困難 26。有研究表明在藍(lán)藻厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣是資源化的過程中,通過補(bǔ)充外源微量元素可以有效提高厭氧微生物活性,鐵元素便是外來元素之一28。亞鐵子能夠有效的提高產(chǎn)甲烷菌酶的活性,而且鐵氧化物是自然界中一種廣泛存在且價(jià)廉易得的礦物,可以作為一種外源添加物在藍(lán)藻的厭氧發(fā)酵中使用。Kato S 研究認(rèn)為,在微生物的氧化還原反應(yīng)中,鐵氧化物充當(dāng)電子載體,能夠有效的加快微生物對有機(jī)物的降解29。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及研究意義在上世紀(jì)70年代國外就已經(jīng)開始了有關(guān)異化Fe(III)還原的研究，研究Fe(III)還原菌的分類、分離、分子機(jī)制及極端環(huán)境條件下異化Fe(III)還原菌，在研究生命起源及進(jìn)化中起到重要的意義，異化Fe(III)還原菌應(yīng)用于放射性核素、石油等碳?xì)浠衔锖屠鴿B濾液污染的地下水的原位修復(fù)，異化Fe(III)還原菌還在產(chǎn)生微生物燃料電池方面作了大量的原創(chuàng)性工作。雖然目前對Fe(III)還原菌的研究已經(jīng)做了大量的工作，但是國內(nèi)在這方面的研究還比較少；國外大多數(shù)是關(guān)注于海洋、湖泊和沼澤等生態(tài)系統(tǒng)的研究，對藍(lán)藻中的Fe(III)還原菌研究卻比較少。Fe(III)還原菌的形態(tài)多異，營養(yǎng)類型多樣。但是目前還沒有獲得能夠?yàn)镕e(III) 還原菌通用的功能性基因，這就極大的阻礙了Fe(III) 還原菌在生態(tài)系統(tǒng)中的原位研究；如果能夠借助于日益先進(jìn)的生物分子學(xué)技術(shù)找到功能性基因，這將會(huì)大大促進(jìn)Fe(III)還原菌的研究和其在生物修復(fù)方面的應(yīng)用。我國擁有大面積的湖泊資源，但很多湖泊及河流都受到了藍(lán)藻的污染，所以十分有必要深入了解藍(lán)藻中的Fe(III)還原菌的多樣性；且藍(lán)藻是湖泊河流中的一種微生物，是由于大量氮、磷等營養(yǎng)元素的排入而產(chǎn)生的藍(lán)藻爆發(fā)。Fe(III)還原菌既在生態(tài)系統(tǒng)中既是碳循環(huán)的驅(qū)動(dòng)者，同時(shí)又是氮循環(huán)的參與者。Fe(III)還原菌如Geobacter除了參與還原鐵氧化物外，還參與了NO3 、依賴型鐵Fe(III)還原和Fe(III) - NH+4 很可能也具有與氧化還原耦合的關(guān)聯(lián)。此外，F(xiàn)e(III)還原菌(Geobacter)還具有固氮酶，而固氮菌（Clostridia）同時(shí)也是一種異化Fe(III)還原菌?？傊?，F(xiàn)e(III)還原菌與C、N代謝有著密切的聯(lián)系。深入的研究微生物介導(dǎo)的C-Fe-N耦合的機(jī)制，探究Fe(III)還原菌在生態(tài)系統(tǒng)中 C、N 代謝的生態(tài)意義將會(huì)推動(dòng)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的生物地球的化學(xué)循環(huán)30。Fe(III)還原菌在生物修復(fù)中有巨大的潛力，研究Fe(III)還原菌在生物修復(fù)中的應(yīng)用,對開發(fā)出既經(jīng)濟(jì)又高效的修復(fù)途徑在人類生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展方面具有重要時(shí)代意義。除了通過添加單一的電子供體來刺激Fe(III)還原菌的生長來提高污染物的去除率之外，添加導(dǎo)電材料在Fe(III)還原菌生物修復(fù)中的作用機(jī)制和應(yīng)用同時(shí)也需要進(jìn)一步研究。在自然界之中, Fe(III)能夠被生物還原成 Fe2+。不管Fe3+是以溶解態(tài)還是固態(tài)的形式存在。微生物細(xì)胞與固體礦物之間的電子傳遞是控制巖石圈能量交換的基本過程27。Fe(III)不可能與外周胞質(zhì)蛋白直接結(jié)合,因?yàn)樗鼈兪且噪y溶的固體形式存在于細(xì)胞表面之外,并且在大多數(shù)條件下不能通過細(xì)胞外膜。但是有一些還原鐵氧化物的細(xì)菌可以做到這一點(diǎn),它們通過將相關(guān)細(xì)胞色素置于細(xì)胞外膜外表面使得其接觸到氧化物表面從而實(shí)現(xiàn)傳遞電子27。還有其他的機(jī)制包括生物合成具有電子受體和電子供體特性的水溶性有機(jī)化合物充當(dāng)電子梭促進(jìn)電子傳遞31。2008 年,Von Canstein 等32，報(bào)道還原金屬的希瓦氏菌屬可以分泌核黃素(維生素B2)和黃素單核甘酸(FMN)充當(dāng)電子梭促進(jìn)結(jié)晶度低的 Fe3+氧化物的還原。1.3 研究內(nèi)容 本文采用希瓦氏奧奈達(dá)菌（Shewanella puterfaciens CN32，簡稱 CN-32）CN-32 為研究菌株和人工合成的針鐵礦、人工配置的Fe-NTA為兩種不同的電子受體，并在不同電子受體的培養(yǎng)基中加入導(dǎo)電材料CNTs或石墨。構(gòu)建營養(yǎng)充足的、pH 為中性的厭氧環(huán)境體系，研究了不同鐵源及導(dǎo)電材料的添加對Shewanella puterfaciens CN32鐵還原過程的影響研究，討論了不同鐵源及導(dǎo)電材料的添加對Fe(III)的還原效果的影響及不同條件下細(xì)菌分泌蛋白的差異。第二章 Shewanella puterfaciens CN32及測試指標(biāo)標(biāo)線2.1 CN32菌準(zhǔn)備 所用菌種為奧奈達(dá)湖希瓦氏菌Shewanella puterfaciens CN32由中國海洋微生物菌種保藏管理中心提供(MCCC，編號(hào)1A01706)。培養(yǎng)基：好氧培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南33，pH 7.2。CN-32菌株的活化、傳代和培養(yǎng)均在好養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行，使用 LB 培養(yǎng)基（10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母膏，10 g/L NaCl）于室溫下活化三代。然后進(jìn)行洗菌和收菌。2.1.1 收菌方法 燃燒的酒精燈邊，12000 rpm,5 min,洗滌3次。需要的儀器：預(yù)先滅菌:50mL壓蓋式離心管（保鮮袋裝），1mL移液槍，200mL無機(jī)培養(yǎng)基；需提前準(zhǔn)備但無需滅菌：冰盒（取冰用），廢液缸，酒精燈，打火機(jī)。 收菌及洗菌時(shí)重懸洗菌的操作方法：（操作必須在酒精燈邊，并且每次使用都要用火焰輕燎，保證無菌）離心后棄去上清夜，燃燒的酒精燈邊，菌體沉淀中用滅菌過的1mL搶打入5mL無機(jī)培養(yǎng)基，反復(fù)抽吸直至分散完全，將離心管蓋及管口在火焰邊輕晃后蓋緊離心管進(jìn)行離心，第3次洗菌可以將菌液用槍合并在一起后進(jìn)行。2.1.2測收菌后OD值 取0.1mL濃縮菌，稀釋至10mL后用紫外分光光度計(jì)測定，波長為600nm.2.1.3接菌將所需濃縮菌液按照收菌后的OD值算好，在無氧條件下，用1mL一次性針管取菌也注入滅好菌的厭氧瓶中。2.2鐵標(biāo)線試劑：（1）鐵標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱量0.7020g硫酸亞鐵銨(（NH4)2Fe(SO4).6H2O ),溶于50mL的（1+1）硫酸中，轉(zhuǎn)移至1000mL的容量瓶中，加水至標(biāo)線，然后搖勻。此時(shí)溶液中每升100g鐵。 （2）鐵標(biāo)準(zhǔn)使用液：精確移取25mL鐵標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL的容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻，此時(shí)溶液中每升25g鐵。 （3）（1+3）鹽酸。 （4）10%鹽酸羥胺溶液。 （5）緩沖溶液：40g乙酸銨加入50mL冰乙酸最后用水稀釋到100mL。 （6）0.5%鄰菲啰啉（1,10-phenanthroline）水溶液，加入濃鹽酸幫助于溶解。步驟：依次移取鐵標(biāo)準(zhǔn)使用液0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0置于150錐形瓶中，加入蒸餾水至50mL，再加入1mL的（1+3）鹽酸，1mL10%鹽酸羥胺溶液，之后加入1-2粒玻璃珠。加熱煮沸至溶液剩15mL左右，冷卻至室溫，定量轉(zhuǎn)移至50mL具塞比色管中。加入一小片剛果紅試紙，滴加飽和乙酸鈉溶液至試紙剛變紅，加入5mL緩沖溶液，2mL0.5%鄰菲啰啉，加水指標(biāo)線，搖勻。顯色15min后，用10mm比色皿，以水為對照，在510nm處測吸光度。測得的標(biāo)線為： 表2.1 鐵標(biāo)線濃度(mg/L)吸光度00.08310.29420.50430.67940.86951.068 圖2.1 鐵標(biāo)線2.3菌體生長標(biāo)準(zhǔn)曲線Bradford蛋白含量檢測法標(biāo)準(zhǔn)曲線建立采用牛清蛋白（生工）為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，設(shè)置10、20、40、80、100及200mg/L等不同濃度。移取0.1mL 0.5mol/L NaOH 溶液加入0.9 mL 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，121 下加熱20 min 裂解細(xì)胞。待充分冷卻后，離心懸液（12000rpm,5min），去0.2 mL 上清夜與1 mL Bradfor試劑（生工）混合(1.5 mL離心管內(nèi))，利用分光光度計(jì)于595 nm 波段讀取光度值。表2.2 菌體生長標(biāo)線濃度(mg/L)吸光度00100.08200.142400.250800.4321000.524 圖2.2菌體生長標(biāo)線2.4 SMP蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 Bradford蛋白含量檢測法標(biāo)準(zhǔn)曲線建立采用牛清蛋白（生工）為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，設(shè)置10、20、40、80、100及200mg/L等不同濃度。移去0.2 mL 上清夜與1 mL Bradfor試劑（生工）混合(1.5 mL離心管內(nèi))，利用分光光度計(jì)于595 nm 波段讀取光度值。 表2.3 菌體分泌蛋白標(biāo)線濃度(mg/L)吸光度00100.092200.154400.317800.5391000.621圖2.3 SMP蛋白標(biāo)線第三章 不同鐵源及電材料對Fe(III)的還原效果的影響3.1引言 近年來Fe()還原在環(huán)境重要性越來越受到人們的關(guān)注。Fe()作為電子受體,通過異化型鐵還原菌的異化作用,把Fe()還原成Fe(II),實(shí)現(xiàn)多種有機(jī)物的氧化。無論是固定態(tài)的Fe()還是游離態(tài)的Fe()都可以被鐵還原菌還原成Fe(II)，相比之下游離態(tài)的Fe()比固定態(tài)的Fe()被還原的效果要好些34。電子穿梭體（Electron shuttles）在胞外的Fe()還原中到重要作用，中性 pH 條件下，當(dāng)環(huán)境中的Fe()是以不可溶的復(fù)合物形式存在時(shí), 這些不可溶復(fù)合物中的 Fe()不易與菌體外膜直接接觸。這樣，從菌體外膜蛋白到不可溶復(fù)合物的Fe()的電子傳遞就必須要通過一可溶的中間體來實(shí)現(xiàn)，這一中間體通常被叫作電子穿梭體。電子穿梭體能夠不斷的從外膜蛋白接受電子，之后再把接受的電子傳給Fe()復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)Fe()的還原。3.2材料與方法 3.2.1 培養(yǎng)基準(zhǔn)備 厭氧培養(yǎng)基成分為：20mmol/L 乳酸鈉（電子供體），0.46g/L NaCl， 0.255g/L (NH4)SO4，0.024g/L MgSO47H2O， 20mmol/L(4.766g/L) HEPES，5mL/L 微量元素儲(chǔ)備液，其中添加NTA-Fe及水熱合成針鐵礦作為不同的電子受體，并在不同電子受體的培養(yǎng)基中加入1g/L 導(dǎo)電材料CNTs或石墨，調(diào)節(jié)初始pH為7.2，鼓氮?dú)馀艃羝績?nèi)空氣，然后用丁基膠塞密封后滅菌。配培養(yǎng)基時(shí)需要多配200 mL無機(jī)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入藍(lán)蓋試劑瓶，半蓋瓶蓋后滅菌，保存待洗菌用。培養(yǎng)基體積為100 mL，添加菌的OD值為0.5。不使用維生素，微量元素直接加到無機(jī)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配完后分裝到厭氧瓶中，通N2 5分鐘后封裝，之后于121高壓蒸汽滅菌，保存待用。微量元素儲(chǔ)備液：表3.1 微量元素儲(chǔ)備液組分Mineral Mix濃度（g/L）NTA1.5MgSO43.0MnSO4.2H2O0.5NaCl1.0FeSO4.7H2O0.1CaCl2.2H2OCoCl2.6H2O0.10.1ZnCl20.13CuSO4.5H2O0.01AlK(SO4).12H2O0.01H3BO30.01Na2MoO40.025NiCl2.6H2O0.024Na2WO4.2H2O0.0253.2.2 實(shí)驗(yàn)材料 菌株：奧奈達(dá)湖希瓦氏菌Shewanella puterfaciens CN32。 固定態(tài)鐵源：人工合成的針鐵礦。游離態(tài)鐵源：Fe-NTA，根據(jù)Reed et al.( 2007)的方法制備35。導(dǎo)電材料：CNTs，325目球形石墨。3.2.3儀器表3.2 儀器儀器名稱型號(hào)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司電子天平FA2004N上海市菁華紫外-可見分光光度計(jì)U-301Hitachi 公司立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-75KBS上海申安醫(yī)療器械廠高純水機(jī)GREEN-10T南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司冷凍離心機(jī)Neofuge 18RHeal Forc恒溫培養(yǎng)箱THZ-90A上海一恒科技有限公司pH 計(jì)雷磁 PHS-3C上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用厭氧瓶為反應(yīng)體系，體積為100 mL 。實(shí)驗(yàn)用針鐵礦、NTA-Fe兩種鐵源，不同鐵源設(shè)置對照、石墨、CNTs三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置A、B反應(yīng)體系。6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，共需要12個(gè)厭氧瓶，厭氧瓶塞處用丁基膠塞塞住后再用瓶塞擰緊。將這6個(gè)實(shí)驗(yàn)組置于培養(yǎng)箱中，定期從反應(yīng)體系中取一定量的混合溶液進(jìn)行分析、測量。組成：表3.3 反應(yīng)體系組成類別電子供體電子受體菌株添加劑針鐵礦石墨物質(zhì)乳酸鈉S.Puterfaciens CN32NTA-FeCNTs 實(shí)驗(yàn)分組: 表3.4 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組StrainssubstrateFe(III)(20mM)Additives(1 g/L)gra-1Shewanella puterfaciens CN32乙酸鈉goethitegraphiteCNT-1CNTscontrol-1gra-2NTA-FegraphiteCNT-2CNTscontrol-23.3.1 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中所測得的數(shù)據(jù)需要用Excel進(jìn)行整理，然后運(yùn)用Origin8繪制圖表。3.3.2 測定周期 測定周期：12h，24h，36h，48h，60h，84h。3.4實(shí)驗(yàn)分析方法3.4.1分析指標(biāo) 液相指標(biāo)：核黃素、FMN、Fe(II)。 固相指標(biāo)：HCl提取態(tài)Fe(II)。3.4.2 Fe(II)濃度離心1mL樣品懸液（12000rpm,5min）。溶解態(tài)Fe(II)：取0.5mL上清液稀釋，1mL稀釋液 + 1mL鐵緩沖溶液 + 0.4鄰菲羅啉，稀釋至10mL，顯色5-10min,利用分光光度計(jì)于510 nm 波段讀取光度值。HCl可提取態(tài)Fe(II)：沉淀用20mL純水重懸，取1mL懸液與1mL 1mol/L HCl混合，室溫下靜置5min，離心（12000rpm,5min），取1mL上清液 + 1mL鐵緩沖溶液 + 0.4鄰菲羅啉，稀釋至10mL，顯色5-10min,利用分光光度計(jì)于510 nm 波段讀取光度值.3.4.3黃素 在給定的時(shí)間間隔內(nèi)，從厭氧瓶中取出少量混合液，12000rpm,5分鐘離心，之后過0.22m的濾膜。取100L過膜后的溶液注入到液相色譜中（LC-1100，Agilent Inc.,USA），該液相色譜配置C18columm(Waters Inc.,Ireland)。流動(dòng)相由25%甲醇和75%醋酸銨（0.05M，去離子水配置，PH 7.0）組成，流量 0.8ml/min。黃素類物質(zhì)由RF-10AXL熒光檢測器（Shimadzu Co.,Japan）在激發(fā)波長420nm和發(fā)射波長525nm處檢測。為了獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置FMN和RBF（Sigma,Inc.,USA）標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1到10M。樣品中FMN和RBF的濃度通過與標(biāo)準(zhǔn)面積比較對應(yīng)峰的積分面積測定。3.5 結(jié)果與討論 3.5.1 針鐵礦及電材料對Fe(III)的還原效果的影響3.5.1.1 溶解態(tài)Fe(II)研究以針鐵礦為鐵源添加不同導(dǎo)電材料的實(shí)驗(yàn)組，從圖3.1中可以看到溶解態(tài)的Fe(II)在對照組的濃度要高于石墨組及CNTs組，而石墨組的溶解態(tài)Fe(II)的濃度又要比CNTs的高一些。從中我們可以得出結(jié)論就是添加石墨和CNTs導(dǎo)電材料對溶解態(tài)Fe(II)的濃度溶出有抑制作用，相比之下，添加CNTs組對對溶解態(tài)Fe(II)的濃度溶出的抑制效果比石墨的抑制作用較強(qiáng)。在前24小時(shí)之內(nèi)，對照組與石墨組中的溶解態(tài)Fe(II)的濃度增長較快，而CNTs組的增長速率較慢，24小時(shí)至60小時(shí)之間三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的增長速率相差不大，之后CNTs組的溶解態(tài)Fe(II)的濃度的增長速度有所加快。從圖1中我們可以看到在60-84小時(shí)的時(shí)候，石墨組的溶解態(tài)Fe(II)濃度的增長速率是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中增長速率最快的。圖3.1溶解態(tài)Fe(III)濃度 3.5.1.2 HCl可提取態(tài)Fe(II)而從圖3.2中可以看到HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度變化，相比較我們可以看出添加石墨組中的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度要比對照、CNTs組的高。就HCl可提取態(tài)Fe(II)而言，我們可以得出結(jié)論就是：添加石墨對HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度有促進(jìn)作用而添加CNTs對HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度有抑制作用，但促進(jìn)效果不是很明顯而添加CNTs對HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度的抑制效果卻比較大。圖中可以看到石墨組及CNTs組的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度一直呈現(xiàn)出增長的趨勢，對照組的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度整體呈現(xiàn)增長的趨勢，但在48小時(shí)和84小時(shí)的時(shí)候濃度卻出現(xiàn)了反常。到達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，發(fā)現(xiàn)對照組合石墨組的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度相差不多，為3.505mg/L與3.582mg/L。 圖3.2 鹽酸提取Fe(III)濃度 3.5.1.3 總Fe(II)的濃度為了更加方便的討論Fe(III)的還原的效果，我把溶解態(tài)Fe(II)的濃度和HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度進(jìn)行相加，得到了總Fe(II)的濃度。并繪制了圖3.3（總鐵濃度），從圖3.3中我們可以從整體中看出添加石墨和CNTs對Fe(III)的還原都有一定的抑制作用，添加CNTs組從反應(yīng)開始到反應(yīng)結(jié)束，二價(jià)鐵的濃度相對于對照組都要低。而添加石墨組在前24小時(shí)內(nèi)對Fe(III)的還原效果與對照組的還原效果相差不大，24小時(shí)之后添加石墨的實(shí)驗(yàn)組才表現(xiàn)出對Fe(III)的還原的抑制作用。從圖中我們可以看到在84小時(shí)的時(shí)候，石墨組的總鐵濃度要高于對照組的總鐵濃度，對于這個(gè)現(xiàn)象的出現(xiàn)，可以用上面所提到的圖3.1中石墨組的溶解態(tài)Fe(II)的濃度相對于60小時(shí)的溶解態(tài)Fe(II)的濃度增長速率較大。及圖3.2中對照組的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度要低于60小時(shí)的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度來解釋。圖3.3 總Fe(III)濃度從針鐵礦與導(dǎo)電材料的實(shí)驗(yàn)組可以看出：添加CNTs對實(shí)驗(yàn)一直是抑制作用，對照組的最高總Fe(II)的濃度為9.245mg/L。石墨組的最高總Fe(II)的濃度為7.826mg/L。CNTs組的最高總Fe(II)的濃度為6.381mg/L。 3.5.1.4 黃素、FMN及RBF 圖3.4 RBF濃度圖3.4為針鐵礦為鐵源的實(shí)驗(yàn)組的RBF的濃度，從圖中可以看到，RBF的濃度在前12小時(shí)增長速率很大分別為。對照組中的RBF濃度在逐漸的增長，到反應(yīng)結(jié)束到達(dá)最高濃度為0.219M。從12小時(shí)到60 小時(shí)增長速率較低，而從60小時(shí)到96小時(shí)速率突然增大。石墨組的RBF濃度從小時(shí)后開始下降，到達(dá)60小時(shí)后又突然增長。而CNTs組的RBF濃度也是從12小時(shí)后開始下降，但下降到達(dá)36小時(shí)后又開始緩慢上升，到達(dá)60小時(shí)后突然增長速率變大。石墨和CNTs的RBF最大濃度都是在12小時(shí)的，說明在前12小時(shí)添加導(dǎo)電材料的實(shí)驗(yàn)組分泌的RBF量最大，添加這兩種材料的細(xì)菌分泌RBF有一定的抑制作用。 圖3.5 FMN濃度圖3.5是以針鐵礦為鐵源的實(shí)驗(yàn)組中的FMN濃度的變化，從圖中的整體趨勢可以看出添加了石墨和CNTs這兩種導(dǎo)電材料之后對FMN的分泌有一定的抑制作用。前12小時(shí)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的FMN濃度都增長的比較快。同樣的對照組中的FMN濃度還是在緩慢的增長，到反應(yīng)結(jié)束最高濃度到達(dá)1.7095M。石墨組在12小時(shí)之后開始下降，開始下降緩慢，之后突然下降的很快，但到達(dá)60小時(shí)到96小時(shí)內(nèi)FMN的濃度突然增長的很快，反應(yīng)結(jié)束FMN的濃度到達(dá)最大并且超過了對照組的最大濃度，為1.8585M。而添加CNTs組的FMN濃度從12小時(shí)的最大濃度后就開始下降，然后又開始上升，但上升的趨勢不大。為了更好的討論細(xì)菌分泌的黃素類物質(zhì)，我把RBF和FMN相加起來，得到了圖3.6。圖3.6 flavins濃度圖3.6為兩種黃素類物質(zhì)的加和濃度，從flavins中可以看到添加了石墨及CNTs這兩種導(dǎo)電材料后對flavins的分泌有一定的抑制作用，前12小時(shí)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的flavins濃度都增長的比較快。對照組中的flavins濃度還是在緩慢的增長，到96小時(shí)到達(dá)最高濃度為1.9285M。石墨組在12小時(shí)之后開始下降，開始下降緩慢，之后突然下降的很快，但到達(dá)60小時(shí)到96小時(shí)內(nèi)flavins的濃度突然增長的很快，反應(yīng)結(jié)束flavins的濃度到達(dá)最大并且超過了對照組的最大濃度，為2.024M。而添加CNTs組的FMN濃度從12小時(shí)的最大濃度后就開始下降，然后從36小時(shí)后開始上升，但上升的趨勢不大。 3.5.1.5討論對于針鐵礦為鐵源的實(shí)驗(yàn)組，添加石墨及CNTs對Fe(III)的還原效果有一定的抑制作用，而CNTs的抑制作用比石墨的作用要大。針鐵礦是固態(tài)鐵源，在體系中Fe(III）從電子供體中通過細(xì)菌傳遞電子而接受電子，從而實(shí)現(xiàn)Fe(III)還原，還原成的Fe(II)在反應(yīng)體系中是以溶解態(tài)Fe(II)和鹽酸可提取態(tài)Fe(II)的形式存在。到停止實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，對照組、石墨組及CNTs組中的濃度為最高濃度，各為9.245mg/L、7.826mg/L、6.381mg/L，對照組中總Fe(II)濃度比石墨組多18.1%，對照組比CNTs組總Fe(II)濃度多44.9%。針鐵礦的還原是屬于生物過程，同時(shí)也擔(dān)任著電子受體的作用。導(dǎo)電材料在胞外不可溶的 Fe(III)還原過程中起著重要作用，環(huán)境中的三價(jià)鐵一般是以不可溶的形態(tài)存在，這樣的三價(jià)鐵不易與菌體外膜直接接觸，電子穿梭（Electron shuttler）等物質(zhì)的作用是要不斷的從外膜蛋白接受電子，再把接受的電子傳給三價(jià)鐵的復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)三價(jià)鐵的還原36。Shewanella puterfaciens CN32可以分泌兩種黃素類物質(zhì)，F(xiàn)MN和RBF，在本實(shí)驗(yàn)中可以看出黃素類物質(zhì)主要是以FMN。有實(shí)驗(yàn)研究分泌黃素類物質(zhì)對針鐵礦還原的貢獻(xiàn)，他們的測試條件下檢測下得到RBF為主要的物質(zhì)34。FMN和RBF的濃度與細(xì)菌生長的速率有關(guān)，從菌體生長曲線中看出：前12細(xì)菌增長速率大，所以黃素類物質(zhì)在前12小時(shí)前增長的速率也比較大。實(shí)驗(yàn)中RBF在對照、石墨、CNTs中的最大濃度各位0.219M、0.1675M、0.0665M，F(xiàn)MN在對照、石墨及CNTs中的最大濃度則為1.7095M、1.8585M、0.331M。FMN在對照、石墨及CNTs在黃素類物質(zhì)中個(gè)占了88.6%、91.8%、83.3%。大多數(shù)希瓦氏菌屬可以分泌黃素類物質(zhì)作為electron shuttler，而electron shuttler可能幫助一些電子供體將電子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，所以黃素類物質(zhì)在希瓦氏菌的胞外電子傳遞過程中具有不可或缺的作用，F(xiàn)e(III）還原與黃素的功能密切相關(guān)34。從flavins中的濃度可以看出添加CNTs對黃素分泌有抑制作用，從而使添加CNTs在針鐵礦為鐵源時(shí)對Fe(III）還原效果也有抑制作用。3.5.2 NTA-Fe及電材料對Fe(III)的還原效果的影響 3.5.2.1 溶解態(tài)Fe(II)研究以NTA-Fe為鐵源添加不同導(dǎo)電材料的實(shí)驗(yàn)組，我們從圖3.7中可以看到溶解態(tài)Fe(II)的濃度在石墨組及CNTs組的濃度都要高于對照組，而CNTs組溶解態(tài)Fe(II)的濃度要比石墨組的溶解態(tài)的Fe(II)的濃度高一些。單從溶解態(tài)的Fe(II)濃度中我們可以得出結(jié)論就是添加石墨和CNTs導(dǎo)電材料對溶解態(tài)的Fe(II)濃度有促進(jìn)作用。由于NTA-Fe是游離態(tài)的，所以12小時(shí)測得的溶解態(tài)的Fe(II)的濃度要高，之后逐漸轉(zhuǎn)化為HCl可提取態(tài)Fe(II)。在24小時(shí)、36小時(shí)及60小時(shí)中我們可以看到溶解態(tài)的Fe(II)的濃度都低于12小時(shí)及48小時(shí)的濃度，這是都是因?yàn)槿芙鈶B(tài)Fe(II)與HCl可提取態(tài)Fe(II)相互轉(zhuǎn)換的結(jié)果，所以溶解態(tài)Fe(II)的濃度就呈現(xiàn)出上升隨后下降的趨勢。圖3.7 溶解態(tài)Fe(III)濃度 3.5.2.2 HCl可提取態(tài)Fe(II)而從圖3.8中可以看到HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度變化，相比較我們可以看出添加CNTs組中的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度要比對照、CNTs組的高，單從HCl可提取態(tài)Fe(II)來看，我們可以得出結(jié)論就是：添加CNTs對HCl可提取態(tài)Fe(II)有促進(jìn)作用。從圖3.8中我們可以看到在48小時(shí)的時(shí)候，CNTs組的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度達(dá)到最大濃度，最高濃度為4.945mg/L。而石墨與對照組達(dá)到最大濃度的時(shí)間為60小時(shí)，最高濃度分別為3.828mg/L、3.977mg/L。由此可見添加CNTs能夠促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，加快了反應(yīng)的速率。在前24小時(shí)內(nèi)，石墨組的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度要比對照組的要高，之后對照組的HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度反而超過了石墨組的濃度。由于NTA-Fe為溶液，所以在測HCl可提取態(tài)Fe(II)的時(shí)候有可能存在部分的溶解態(tài)Fe(II)以及實(shí)驗(yàn)上的誤差，因此可能存在圖3.5中對照組108小時(shí)的HCl可提取態(tài)Fe(II)突然比石墨組的濃度低。圖3.8 鹽酸提取態(tài)Fe(III)濃度 3.5.2.3 總Fe(II)的濃度為了方便的討論Fe(III)的還原的效果，我同樣把溶解態(tài)Fe(II)的濃度和HCl可提取態(tài)Fe(II)的濃度進(jìn)行了整理，得到總Fe(II)的濃度。并繪制了圖3.9（總鐵濃度）。總鐵濃度的變化毫無規(guī)律可言，但三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的變化規(guī)律是一樣的，都是呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降再上升又下降的趨勢。在24小時(shí)、36小時(shí)及60小時(shí)中可以看到總Fe(II)的濃度要低于12小時(shí)及48小時(shí)的濃度，同樣的還有12小時(shí)測得的總Fe(II)的濃度較高。對照組最高濃度為12小時(shí)，133.328mg/L，之后總Fe(II)的濃度就在一定濃度范圍內(nèi)波動(dòng)，最后濃度到達(dá)一個(gè)平衡點(diǎn)。而石墨組在12小時(shí)的濃度也較高為123.542mg/L，之后就下降，進(jìn)過一天的反應(yīng)后便到達(dá)這個(gè)實(shí)驗(yàn)組的最高濃度為149.747mg/L，之后總Fe(II)的濃度就在一定濃度范圍內(nèi)波動(dòng)，最后總Fe(II)的濃度到達(dá)平衡點(diǎn)。添加CNTs組在12小時(shí)時(shí)總Fe(II)的濃度也較高為154.566mg/L。和石墨組的情況一樣，到48小時(shí)時(shí)濃度到達(dá)最高，最高為157.4mg/L，之后濃度又下降，最后到達(dá)濃度的平衡。這三個(gè)實(shí)驗(yàn)組總Fe(II)的濃度隨時(shí)間的變化趨勢是同步的，對于實(shí)驗(yàn)為什么會(huì)出現(xiàn)這樣的情況，暫時(shí)還不能解釋。但從圖6中我們可以從整體中添加石墨和CNTs對Fe(III)的還原都有一定的促進(jìn)作用。CNTs對Fe(III)的還原效果的促進(jìn)作用更好。圖3.9 總Fe(III)濃度 3.5.2.4 黃素、FMN及RBF圖3.10為NTA-Fe實(shí)驗(yàn)組為鐵源中的RBF的弄得變化。對照組、石墨組及CNTs組的RBF濃度在前12小時(shí)內(nèi)都快速增加，都達(dá)到了最高濃度分別為1.0525M、0.9735M、0.756M。之后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的RBF濃度都在逐漸的減少，石墨組的RBF濃度在每個(gè)時(shí)間段上都在CNTs和對照組的RBF濃度之間。從RBF來看添加石墨和CNTs這兩種導(dǎo)電材料對RBF的分泌有抑制作用，而CNTs對細(xì)菌分泌RBF的抑制作用更強(qiáng)。圖3.10 RBF濃度 圖3.11是以NTA-Fe為鐵源添加不同導(dǎo)電材料的FMN的濃度。從圖中可以看出添加石墨和CNTs這兩種導(dǎo)電材料對FMN的分泌都有抑制作用，而添加CNTs對細(xì)菌分泌FMN的抑制作用要強(qiáng)一些。對照組、石墨組及CNTs組的RBF濃度在前12小時(shí)內(nèi)都快速增加，都達(dá)到了最高濃度分別為5.1395M、5.192M、3.933M。之后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的RBF濃度都在逐漸的減少，到達(dá)36小時(shí)后，各組的FMN濃度都急劇下降。圖3.11 FMN濃度 為了更方便的討論細(xì)菌分泌黃素類物質(zhì)的能力，我把NTA-Fe為鐵源中的RBF和FMN濃度進(jìn)行加和，得到了flavins濃度圖。 圖3.12 flavins濃度 從圖中可以看出添加石墨和CNTs這兩種導(dǎo)電材料對flavins的分泌都有抑制作用，而添加CNTs對細(xì)菌分泌flavins的抑制作用要強(qiáng)一些。由于flavins是由RBF和FMN濃度的加和，因?yàn)镕MN的濃度要比RBF濃度大的多，所以flavins的圖形變化趨勢和FMN濃度圖的變化趨勢一樣。 3.5.2.5 討論對 Fe(III)還原是一個(gè)由微生物介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)，因此影響到 Fe(III)還原的因素有Fe(III)還原微生物種類、Fe(III)的形態(tài)、電子供體和電子受體的種類以及其它的環(huán)境條件。在以NTA-Fe為電子受體的實(shí)驗(yàn)中，可以看出我們添加的不同導(dǎo)電材料石墨及CNTs對Fe(III)還原有一定的促進(jìn)作用，且添加CNTsFe(III)還原的效果更好。導(dǎo)電材料可以將電子從電極傳遞到細(xì)胞，同時(shí)也可以加速電子從細(xì)胞到電子受體的傳遞，所以導(dǎo)電材料對Fe(III)的還原效果既有抑制作用的，同時(shí)對Fe(III)的還原效果也有促進(jìn)作用的34。NTA-Fe是游離態(tài)的鐵源，在體系中Fe(III）從電子供體中通過細(xì)菌傳遞電子而接受電子，從而實(shí)現(xiàn)Fe(III)還原，還原成的Fe(II)在反應(yīng)體系中是以溶解態(tài)Fe(II)和鹽酸可提取態(tài)Fe(II)的形式存在。Shewanella puterfaciens CN32可以分泌兩種黃素類物質(zhì)，F(xiàn)MN和RBF，在以NTA-Fe鐵源的實(shí)驗(yàn)中可以看出黃素類物質(zhì)主要是FMN。已有文章提到水鐵礦抑制FMN和RBF的分泌，而Fe(III)-NAT對FMN和RBF的分泌有刺激作用，由于其高溶解度，F(xiàn)e(III)-NAT可以被Shewanella puterfaciens CN32迅速還原，與水鐵礦相比會(huì)導(dǎo)致更高的能量產(chǎn)生。這可能解釋Fe(III)-NAT對黃素類物質(zhì)分泌的刺激效應(yīng)，該效應(yīng)可能是一個(gè)依賴能量的過程34。Flavins的濃度圖中，可以看出對照組的Flavins濃度都要高于石墨組和CNTs組，這說明了添加這兩種導(dǎo)電材料對Flavins的分泌有抑制的效果。按理說鐵還原的效果也應(yīng)該與黃素類物質(zhì)的濃度變化趨勢一樣，但實(shí)際上是添加石墨和CNTs對Fe(III)的還原有促進(jìn)作用。由于個(gè)人時(shí)間和能力有限，沒能找出為什么出現(xiàn)這樣的原因。3.6 本章小結(jié)本章是研究不同鐵源及添加導(dǎo)電材料對Fe(III)還原效果影響的研究，從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，得出：以針鐵礦為鐵源，添加石墨及CNTs對Fe(III)還原有一定的抑制作用。而以NTA-Fe為鐵源時(shí)，添加石墨及CNTs對Fe(III)還原有促進(jìn)作用。在細(xì)菌 Fe() 呼吸鏈的電子傳遞途徑過程中；電子由電子供體向醌類中間體的傳遞、電子從醌類( MQ)中間體傳給 CymA、由 CymA 向周質(zhì)細(xì)胞色素的傳遞、電子由周質(zhì)傳到外膜蛋白、細(xì)胞外膜的末端還原酶把電子交給 Fe()30。所以導(dǎo)電材料對Fe(III)還原效果的影響差異很大，且影響的途徑之多，所有就會(huì)產(chǎn)生不同的效果。實(shí)驗(yàn)初期鐵（III）源都是10mM，被還原成Fe(II)后，對照組的Fe(II)最高濃度分別為：針鐵礦 9.245mg/L、NTA-Fe 133.328mg/L。石墨組的Fe(II)最高濃度分別為：針鐵礦 7.826mg/L、NTA-Fe 149.747mg/L。CNTs組的Fe(II)最高濃度分別為：針鐵礦 6.381mg/L、NTA-Fe 157.4mg/L。從上面的數(shù)據(jù)中我們可以看出，以NTA-Fe為鐵源比以針鐵礦以鐵源對Fe(III)還原效果更好。之前已有對硝酸抑制鐵(III)還原的報(bào)道，硝酸鹽呼吸會(huì)明顯抑制鐵還原37。當(dāng)電子供體足夠的條件下TMAO呼吸可能不會(huì)妨礙鐵還原38。所以可得出不同的電子受體對鐵還原的效果不一，本實(shí)驗(yàn)只是研究了兩種不同電子受體對Fe(III)還原效果影響，鐵還原對環(huán)境有著重要的作用，所以研究電子受體對鐵還原還需要進(jìn)一步的調(diào)查與研究。第四章 不同條件下細(xì)菌分泌蛋白的差異4.1引言分泌蛋白質(zhì)是指由組織、細(xì)胞等分泌的蛋白質(zhì)，分泌蛋白(secretory