瘧原蟲檢驗技術(shù) -血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別,黔東南州疾控中心檢驗科 潘雪雪,寄生人體的四種瘧原蟲,間日瘧原蟲 P. vivax，P.v 惡性瘧原蟲 PFalciparum,P.f 三日瘧原蟲PMalariae,P.m 卵形瘧原蟲POvale,P.o 我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲；另二種少見，近年偶見國外輸入病例。 其它瘧原蟲 諾氏瘧原蟲(Plasmodium nowlesi),內(nèi)容提綱,血片制作與染色 瘧原蟲計數(shù) 瘧原蟲的基本形態(tài)特征,血片制作,第一步：載玻片的清洗 用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，清水沖洗后涼干，浸于95% 的乙醇中1小時以上 用綢布擦干置干燥環(huán)境中保存。,第二步：患都信息的核實,采集血樣涂片時，首先要核對患者的姓名和年齡并在玻片的右側(cè)編號,第三步：采集血樣,采血部位：耳垂或無名指， 取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小,薄血膜血量為厚血膜的一半或1/3。,厚血膜 用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當于火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)24圈，涂成直徑0.81厘米大小圓形厚血膜 薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適 當遠的地方.將 推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動，使血液沿邊緣散開，然后勻速地向前推進，形成薄而平鋪的薄血膜,第四步：血片制作,厚血膜,薄血膜,制片過程圖示,標簽,標準的瘧疾厚薄血膜片,標簽,厚血膜血量不宜過多或過少 薄血膜平整,無皺折和空泡.顯微鏡下紅細胞單層排列,血片的制作,血片制作影響因素,載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細胞均勻分布不重疊、無裂縫、無皺折和空泡，血膜末端呈舌狀； 厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見5-10個白細胞為宜； 血片制作場所要保持清潔，以免塵埃沾污血膜，防止蒼蠅等舔食血膜； 制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果,血片染色,兩種染色方法: 吉氏染色法 1. 染色原液配制 2. 門診快染、慢染 3. 成批染色和溶血染色 瑞氏染色法 WHO推薦使用吉氏染色法,吉氏染液(原液)的配置,吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (純) 250ml 甲醇 (純) 250ml 吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨, 然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾即可使用。保存時間越長染色效果越好。 整個染色液配制時間不能少于5個小時,血片的染色,染色用水和沖洗用水配制 常用中性的蒸餾水或經(jīng)煮沸過濾的冷開水 用pH7.0pH7.2的緩沖液。,血片染色,薄血膜的固定 厚血膜充分干燥, 用甲醇固定薄血膜， 平放待干 （要點：甲醇不能觸碰到厚血膜）,操作1 （快染） 量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0) 或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標本的厚薄血膜上，染色10min，清水緩緩沖洗，晾干（血膜朝內(nèi)面）鏡檢。 操作2 (慢染) 量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水， 再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標本上，染色30min。清水緩緩沖洗，晾干鏡檢。,血片染色,將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 液（3毫升吉氏染色液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，染色30分鐘。 （如染液稀釋液不合標準時，得酌情增減染色時間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾干板上晾干，包裝，待鏡檢。,成批血片染色,厚血膜溶血染色,放置多時未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，須在厚血膜上用清水進行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分鐘。然后用清水漂洗干凈,晾干。,質(zhì)量好的染色 顯微鏡下核呈紅色,胞漿呈藍色，薄血膜平整，紅細胞單層排列 如果血片偏紅,說明染液偏酸性 如果血片偏藍,說明染液偏鹼性,外觀吉氏染色血片,偏 酸,偏 堿,標 準,配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量； 染液稀釋后使用時間：原液必須臨用時稀釋，隨配隨用； 染液的稀釋濃度； 染色時間。,染色質(zhì)量影響因素,用水過酸，可致感染的RBC上的點彩染不出來； 用水過堿，則使薄血膜上的RBC染成灰藍色，致使R的胞漿難以辨論。,染色稀釋用水: PH7.0-7.2清潔水。,染色質(zhì)量影響因素,固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜； 血膜在制備后應盡量能在當天染色，一般夏天不超過48小時，冬天也不能超過72小時,放置時間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。,染色質(zhì)量影響因素,瘧原蟲鏡檢, 瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點 瘧原蟲密度計數(shù)方法 人體四種瘧原蟲的形態(tài)特征,當前分子生物學、血清學技術(shù)快速發(fā)展,但是厚薄血片的檢查仍被認為是不可替 代的確診瘧疾的 “金標準” 顯微鏡檢查是唯一可查到原蟲實體并鑒別4種人體瘧原蟲,原蟲鏡檢-金標準,瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點,瘧原蟲密度計算,計算瘧原蟲密度的三種方法： 白細胞原蟲密度計數(shù)法 (厚血膜 WHO) 優(yōu)點：可作為定性和定量分析 半定量計數(shù)法 (厚血膜) 優(yōu)點：方法簡便 缺點：只能定性，不宜作為定量分析 紅細胞感染密度計算法 (薄血膜),白細胞原蟲密度計數(shù)法,鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細胞中的瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低（200個白細胞中小于100個瘧原蟲），可增加白細胞，計數(shù)500個。 密度單位:原蟲數(shù)/l 計算公式：瘧原蟲數(shù) 計數(shù)的白細胞數(shù) 患者每微升血白細胞數(shù) = 瘧原蟲數(shù)/l血。 如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以8000個白細胞計數(shù)(國際標準) 。,白細胞原蟲密度計數(shù)法,從血膜的左上角開始，橫向。 計數(shù)1個視野后，每次間隔5個視野,再計數(shù)。,厚血膜, 不需要計數(shù)的視野, 需要進行白細胞、瘧原蟲計數(shù)的視野 如果該視野無原蟲，則計數(shù)白細胞數(shù) 看到第一個原蟲開始計數(shù),白細胞原蟲密度計數(shù)方法,白細胞瘧原蟲計數(shù)法,例如 計數(shù)200 WBC中有135個瘧原蟲，在不知患 者白細胞數(shù)的情況下，以每微升血8 000個白細 胞計數(shù), 由此計算出每微升血液瘧原蟲密度為：,135（計數(shù)的瘧原蟲數(shù)）200（計數(shù)的白細胞）x 8000（每微升血白細胞數(shù)） =5400 / l,答：該患者的瘧原蟲密度為5400 / l。,用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密度。此方法將密度分為6級： 1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以內(nèi)，記錄實際數(shù)字 2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少” 3.平均每個視野15個蟲，記錄“” 4.平均每個視野6 10個蟲，記錄“+” 5.平均每個視野11 100個蟲，記錄“+ ” 6.平均每個視野100個蟲以上，記錄“+ ”。 如：Pv R+T+S5G少 這種方法簡便，缺點是計數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。,半定量計數(shù)法,如何確定瘧原蟲血片為陰性, 檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲 最少檢查100個厚血膜視野未查見 瘧原蟲（臨床病人）,人體四種瘧原蟲的分布,瘧原蟲鏡檢,感染人的瘧原蟲有四種:,惡性瘧原蟲 P. falciparum 間日瘧原蟲 P. vivax 三日瘧原蟲 P. malariae 卵形瘧原蟲 P. ovale,惡性瘧 P.falciparum, 分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病 我國流行區(qū)域為云南省和海南省 四種瘧原蟲中致病力最強，無免疫力者 感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時治療可危及生命（腦型瘧）,間日瘧 P.vivax, 間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū),主要是中部地區(qū) 病程良性, 有復發(fā), 遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱 帶非洲，特別是西非則很少見,三日瘧 P.malariae,遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布 三日瘧在我國非常少見，只在南方廣西有過散在報告 卵形瘧 （蛋形瘧） P.ovale 主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報告 在我國已基本消滅,原蟲鏡檢,血細胞,紅細胞 血小板 白細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞）,紅細胞,紅細胞是雙面凹的圓餅狀 邊緣較厚，而中間較薄,血小板,各種血細胞模式圖 1.紅細胞 2.嗜酸性粒細胞 3.嗜堿性粒細胞 4.中性粒細胞 5.淋巴細胞 6.單核細胞 7.血小板,1,2,3,4,5,6,7,瘧原蟲的基本形態(tài)特征,瘧原蟲基本構(gòu)造為細胞質(zhì)(胞漿)、核和瘧色素； 原蟲：經(jīng)吉氏或瑞氏染色：核呈紅色，胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色； 細胞漿：藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，細胞漿逐漸增多； 核：呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結(jié)構(gòu)致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。,核,胞漿,斑點,瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團塊。 間日瘧原蟲：呈短棒狀，黃褐色； 惡性瘧原蟲：呈細砂狀，黑褐色； 三日瘧原蟲：呈砂粒狀，深褐色； 卵形瘧原蟲：與間日瘧原蟲相似。,瘧原蟲的基本形態(tài)特征,瘧色素,2019/8/31,46,可編輯,紅細胞不漲大 環(huán)狀體纖細, 常有多重感染，環(huán)狀體內(nèi)可有2個核 環(huán)狀體可貼在紅細胞邊緣 除環(huán)狀體，配子體外沒有其他發(fā)育期 配子體呈新月形或臘腸形 成熟裂殖體約含16-32個裂殖子，排列不規(guī)則 可出現(xiàn)茂氏點,惡性瘧（P.falciparum） 鑒定要點,21. A member of the UN forces in East Timor. Presented with high temperature.,紅細胞明顯漲大 薛氏點明顯 成熟環(huán)狀體粗大 滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足 血片中可見各期的原蟲形態(tài) 成熟裂殖體約含12-24個裂殖子,間日瘧（P. vivax ） 鑒定要點,2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago.,紅細胞不漲大或略小 環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚 胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含6-12個裂殖子 雌雄配子體小于正常紅細胞，色素呈深褐色 常可查見各階段的瘧原蟲,三日瘧（P.malariae） 診斷要點,卵形瘧（P. ovale ） 鑒定要點,紅細胞正?；蚵詽q大 常見慧星狀 (也稱齒輪狀) 環(huán)粗大 薛氏點明顯 成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲但更粗大 成熟裂殖體約含6-12個裂殖子,18. Recent trip to Southern India- headaches and vaguely unwell.,混合感染的鑒別,容易鑒別的混合感染 1）同一血膜中發(fā)現(xiàn)間日瘧各期原蟲和惡性瘧雌雄配子體。 2）同一血膜中發(fā)現(xiàn)大量纖細的惡性瘧環(huán)狀體，并混有少量間日瘧原蟲。 不易鑒別的混合感染 1）間日瘧各期原蟲和粗環(huán)的惡性瘧環(huán)狀體。 2）僅有間日瘧和惡性瘧的環(huán)狀體。,厚血膜中容易被誤認為瘧原蟲的物質(zhì), 未成熟的網(wǎng)織紅細胞溶血后的殘影易被誤為薛氏點 重疊的血小板易被誤為裂殖