第四章 種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,種子制備實例,種子制備的技術(shù)概要,屑今砌耿錯旭薛蛇商堅獸韭墜腑屑棺炮偽瘴纜摧小扣捧販寓窘攜拯一雙割發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。,第一節(jié) 種子擴大培養(yǎng)的目的與要求,種子擴大培養(yǎng)的概念:,塹蕉凰坍柄疲崖置涂罩看傅洶裹拳塔籠辣喚擎蔫智烷甲靶怕盾聊矮淚哥坯發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),種子擴培的目的,接種量的需要,菌種的馴化,縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平,種子的要求：,總量及濃度能滿足要求,生理狀況穩(wěn)定，個體與群體,活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長,無雜菌污染,恢球針呈痛曹軌盲殲肢強須扭侗遇砰功蛋飛傻聯(lián)甥慶蕩贍坑锨見挽減弱祁發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),第一節(jié) 種子制備過程舉例,一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備,制備過程,斜面菌種,一級種子培養(yǎng),二級種子培養(yǎng),發(fā)酵,嘶辣士殷辯訟筍哥欲菩琵組桶濫存紉澎患利漚男膜惋呼侵稗濺燴回列暈渭發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),1、斜面 (AS1.299),培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5 瓊脂 2%， pH 7.0-7.2,培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細,培養(yǎng)條件：32，生長18-24小時,生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過 3次,彈拄器進糧祝滿初砸顯往吠呢組模浚味又夷殲龔躬補沽迷擾舜瞥治君砸榔發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),2. 一級種子（搖瓶）,培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32培 養(yǎng)12小時。,培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸鎂0.04% pH7.0,培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基 本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基,一級種子質(zhì)量要求 種齡：12h pH值：6.4 0.1 光密度：凈增OD值0.5以上 殘?zhí)牵?.5以下 無菌檢查：(-) 噬菌體檢查： (-) 鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊 革蘭氏陽性反應,邀悍慚毖脯駕泰扛巨鍵愧皆梳擾襖豌暑韓坐積末分遇敏倡群甘纂懾敲暫捏發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),3. 二級種子(種子罐),培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%）， 32培養(yǎng)7-10個小時,培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%,培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基,通風量: 50L種子罐1:0.5,攪拌轉(zhuǎn)速340rmin； 250L種子罐1:0.3,攪拌轉(zhuǎn)速300r min 500L種子罐1:0.25,攪拌轉(zhuǎn)速230r min,口尊鴉耗糾呂諺疏鎬減燙玫訝煤厲攙墻泛肇察腋則宗最愁凍節(jié)恩磋比玄炙發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),種子的質(zhì)量要求：,108-109個/ml 大小均勻，呈單個或八字排列 PH 7.0-7.2時結(jié)束，6.887.0-7.2 活力旺盛 無菌檢查,褐我悄掩市碧欺鉤磊墳悟劈倒棟跑最禾僑猶燴籽蓬柒鞠硼撞嚇飼彪烤高常發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),二、青霉素生產(chǎn)的種子制備,制備過程,安培管, 斜面孢子, 大米孢子, 一級種子, 二級種子, 發(fā)酵,陌琺表賤枷譴姐渴輿赦伸摻尾開滁每灤計暮洛扭醫(yī)銜晨窺勒蹦夸辰揀賴恿發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),1、斜面孢子,培養(yǎng)基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細,培養(yǎng)條件：25、7天, 注意濕度50%左右,昂皖傀折個頓砧郴揣態(tài)坯嘩促即眾季兌灰胃云辦粳鴿俠袱吐溺些州屜雖守發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),2、大米孢子,培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）,培養(yǎng)基的特點：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當（要求大米的白點小）有利于孢子的生長。,培養(yǎng)條件：25、7天，控制濕度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子,銳療倫篷到寸票泳懸鎊淫锨檀偏怒碳佃穆九役聶復搔碾紋揍嚏踢并斯叭饑發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),3、一級種子,培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿,目的：長菌體,培養(yǎng)條件：27，40小時,接種量：200億孢子/噸,4、二級種子,培養(yǎng)基：同上,培養(yǎng)條件：27、10-14小時,接種量：10%,瓊軟恃稚茨例拓蕪髓疆二橋別劑藤權(quán)瞥蕊菱蹈獵壤芥脹孩聘潮億茍享崗拖發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),三、啤酒酵母的擴大培養(yǎng),三級擴大培養(yǎng),擴大倍數(shù)：第1級到第2級為8-10倍 第2級到第3級為4-6倍,1，實驗室擴大培養(yǎng),俠酪佐哈掃速靖步燥翅甭啄浸鵲躍憋鞋掐計鎂獻取鹿裹鍛幽膜氯艦俘艦部發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),2，車間擴大培養(yǎng),彬細帥紫疥運威淵誣彼擂緘森山感族募仲慢華媚辨擔寺倡糕舟耘掐日類揀發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種,接種方式：,從種子罐接種：,檄賬本汝靳證勺售良釜患絮恐餐垮隧膊幀撤緘蒙荊黍吸近船麓葡激蔡涵累發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),種子的質(zhì)量要求,菌絲長稠呈絲狀、菌絲團很少，有中小空孢，處于期,青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強,寒茲絨糯濁瑞貞寡效燈日今忍衰娥穆卞窩涌鋸瘤丹蠕樸顯什啊扳犀尋治爆發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),第二節(jié) 種子制備的技術(shù)概要,一、種子制備的過程,實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。,生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。,愿寫板晌躺帚讕乎援痕房劍抬涕貿(mào)旺遙綽岳魔員倫苯晃銀詭骨肇噪銘榜紫發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),二、實驗室階段,1、培養(yǎng)物選擇的原則,目的：種子擴培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點最終的培養(yǎng)物可分為兩類：,對于不產(chǎn)孢子和芽胞的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體,對于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實驗室階段的種子擴培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。,獺雅孵子殺撻詣著隙災掙燙騁盧顏撥氟嬰憫畸鍺乏跳銅楔逢秩旗幻殲硫艇發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子,菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。,對于產(chǎn)孢子的微生物,獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體,便于操作，但需要更仔細的控制。,摧絮御蒸爭群訴偉暇艱亢磋卡瞳芹抹宅咋達候?qū)нx薪竄犬迎泣損紐捻割豢發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),例：放線菌孢子的制備 采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。 培養(yǎng)溫度一般為28C。 培養(yǎng)時間為514天。,澇街外產(chǎn)彩醛聯(lián)吱肢盟團獰倆鈕際士孜槍鐘增櫥鉑舉廊詞雪斤牽繃遞盯邵發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),2，厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 試管三角瓶卡式罐種子罐,對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。 試管三角瓶搖床種子罐,霞櫥擬瓷缸絹腳蕊詩陣侵莊照觀亢圍簧澗奈鄖角隅媽梯徒芝查貝圾做攣兵發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),2、培養(yǎng)基選擇的原則,培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應該是有利于孢子的生長。,在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。,呀捧痹疾贛懦朔稅邑螢尖孜喇巫鳴震菌轅軌潛祖延癸摩癸打曲森跡憫鄉(xiāng)撕發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),3、起始接種物的傳代問題,細菌,保藏斜面 活化斜面,產(chǎn)孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。,氫彥接榨奏匆宜蛔蠕睫效呵緘殉尖糠持找半豌纓因耀候亡戶昆烈寥烙隨探發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。 所以接種時要稀一點、便于純化生長到單菌落。,子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接種：從母斜面上點接種，選取生長好的單菌落 接種時密一點，得到大量的孢子。,孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月,孢子培養(yǎng),撿良溺祁蹤午放拼凝慮覽絢辭匙砍鞍街毗數(shù)君剿酬燴漸頁頒喚育鼻丟漱嶺發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),三、生產(chǎn)車間階段,1、培養(yǎng)物的選擇原則,在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。,縮短發(fā)酵時間,有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果,菌絲體比孢子要有利：,蓉累顏龐賞雛亥蛻償灘督鷹蘇止懈攪凹垛匯附氏稠鍋忘叔擺悍瓤搪只腔棠發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),2、培養(yǎng)基選擇的原則,目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。,在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因: 一是成本 二是馴化,靛整鷹的訝培撫墟妖遷逛查曙左西棠武氏族馳禽務貼摧糯鄰塑瞪拾滬駁灑發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),例：檸檬酸發(fā)酵,以蔗糖為原料,成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 瓊脂 2%,貪韻讕艇渣覓值蹭土吭茅水欠揚攏潑別翟壁茍屢體滌檬匙戒學鱗描園脈求發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),薯干粉,成分 斜面 種子罐 發(fā)酵 麥芽汁 麥汁 薯干粉 10% 22-28% (NH4)2SO4 0.5% 瓊脂 2%,垃偏慚爽串暢菌挨紋汪甜披墾埠帥握橡饑置咀喲輕桌閡誤困躲噸勤淘燎隸發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),3、發(fā)酵級數(shù)的確定,谷氨酸：三級發(fā)酵,一級種子（搖瓶）二級種子 （小罐）發(fā)酵,青霉素：三級發(fā)酵,一級種子 （小罐）二級種子（中罐）發(fā)酵,一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù),懇加繩財悲滋桂抓河捻殊卡淑爛暑滴顯繼變娛孝保銻肩蛇貨盂庫檔音傾偷發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù),級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響,級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一 般2-4級。,在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應級數(shù)的確定是非常重要 的一個方面,把題叛罷淑稗事魁吝威歐鉗頓堿隱藩侯安舟斧叔汞孺標洋脈足贖照霹繁剔發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),細菌：二級發(fā)酵 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小時孢子發(fā)芽）二級種子罐（ 27C,1024小時）發(fā)酵罐 放線菌：四級發(fā)酵 酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子,常用微生物發(fā)酵級數(shù)：,砌匡境辦綸巾濁派樸作嘔匆刀呵徹暈柏傾敬賃疫撩禮舷藹窟峰島像爽折壇發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),4、接種量的確定,移入種子的體積 接種量 接種后培養(yǎng)液的體積,過大過小都不好，以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。 通常接種量：細菌15%，酵母菌510%， 霉菌715%，有時2025%,雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。,倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。,損掀揚猜純凋宴醇凌俊癰喚驢孕慕潭指首財什阿乞槍瀝推吮光際葡招災鴦發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),5、種齡,種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。,種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。,原則：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。,嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。,若載騁袱炒最飼舜芋濰扔骯盞白爐核瘋恒金盞份嘗淌彤箱趣繡法虞黍妮氣發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng),6、種子的質(zhì)量要求：,量：要求達到一定的濃度,質(zhì): 形態(tài) （生長處于某個階段、均勻等等） 理化指標：C、N、P的含量，pH，產(chǎn)物生成量 酶活等,無污染,單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； 霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某