湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要 微分干涉相襯顯微技術(shù)屬雙光束偏振干涉技術(shù)。由于兩束相干光的橫向剪切 量小于顯微物鏡的分辨率極限，使樣品表面微觀起伏的高度變化在相干背景上以 強烈的光強和顏色變化表現(xiàn)出來，使之具有明顯的陰影效果，具有很強的立體感， 直觀形象地反映出生物樣品表面微觀輪廓。微分干涉相襯顯微鏡具有納米級的相 位分辨率，可以看到一般光學(xué)顯微鏡難以觀察到的微細(xì)結(jié)構(gòu)。 本文首先詳細(xì)分析了微分干涉相襯顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)原理，然后對顯微鏡光 機結(jié)構(gòu)做了簡要分析。在現(xiàn)有的顯微鏡上，加裝了起偏鏡、檢偏鏡、n o m a r s k i 棱 鏡。同時為了安裝這些器件，設(shè)計了機械機構(gòu)。對多種方案進行了考慮，最后選 取了簡便實用的方法。 n o m a r s k i 棱鏡設(shè)計是微分干涉相襯顯微鏡的關(guān)鍵技術(shù)。具體來說，就是通過 改變w o ll a s t o n 棱鏡的一些參數(shù)的方法，使w o l l a s t o n 棱鏡的相干平面被移到棱 鏡外部，從而可以實現(xiàn)相干平面與物鏡后焦面重合，使微分干涉相襯顯微術(shù)在高 放大倍率光學(xué)顯微鏡中得以運用。由于n o m a r s k i 棱鏡的一些主要參數(shù)如楔塊楔角、 光軸傾角、分束角、相干平面位置相互關(guān)聯(lián)，某些參數(shù)發(fā)生變化時，其他參數(shù)也 會隨之發(fā)生改變?；谶@些變化關(guān)系，對n o m a r s k i 棱鏡光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的設(shè)計公式 進行了詳細(xì)的推導(dǎo)。并用m a t l a b 軟件自編程序做了具體的設(shè)計實例計算。根據(jù)相 干平面與系統(tǒng)物鏡焦面重合且入射光線和相干面垂直的準(zhǔn)則，建立了棱鏡各參數(shù) 間的關(guān)系模型。最后選取了一組適合本光學(xué)系統(tǒng)的n o m a r s k i 棱鏡設(shè)計參數(shù)，并加 工出了該棱鏡。得到了一些有實用價值的結(jié)論，為進一步實現(xiàn)微分干涉相襯顯微 技術(shù)對生物細(xì)胞的定量測量奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：微分干涉相襯，n o m a r s k i 棱鏡，相干平面，分束角 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 ab s t r a c t d i t t e r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a s t ( d i c ) i sak i n do ft e c h n o l o g yo ft w ob e a m so f p o l a r i z e dl i g h ti n t e r f e r e n c e s i n c et h a tt h el a t e r a is h e a rb e t w e e nt h et w ob e a m si s s m a l l e rt h a nt h ev a l u eo fr e s o l u t i o np o w e ro fo b j e c t i v el e n so ft h em i c r o s c o p y , m i c r o c o s m i ch e i g h tc h a n g eo ft h es u r f a c eo ft h es p a c e m a ni se x h i b i t e do nt h e i n t e r f e r e n c eb a c k g r o u n dw i t ht h ei n t e n s ec h a n g eo fi n t e n s i o na n dc o l o r , s om i c r o c o s m i c p r o f i l eo ft h es p a c e m a nc a nb ev i s u a l l yr e f l e c t e d b e i n go ft h ep h a s er e s o l u t i o np o w e r o fn mi e v e l t h ed l cm i c r o s c o p yc a nd i s c e r nt h em i c r o c o s m i cs t r u c t u r ew h i c hc a n n o tb e o b s e r v e db yt h eo r d i n a r ym i c r o s c o p y i nt h i sd i s s e r t a t i o n t h ek e y s t o n eo fd i 肫r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a s tm i c r o s c o p e i sa n a l y z e d a n dt h eo p t i c sa n dm a c h i n ef l a m eo fm i c r o s c o p ei si l l u m i n a t e db r i e f l y t h e nt h ep o l a r i z e ra n dt h en o m a r s k ip r i s ma r ea d d e di nt h ee x i s t i n gm i c r o s c o p e a tt h e s a m et i m e t h em a c h i n es t r u c t u r ei sd e s i g n e df o rf i x i n gt h ea d d i t i o np a r t i nt h ee n d a s i m p l ea n df e a s i b l em e t h o dw a ss e l e c t e da f t e rc o n s i d e r i n gm a n yk i n d so fp r o g r a m s s e r i o u s l y t h er e s e a r c ho nt h en o m a r s k ip r i s mi st h ek e yt e c h n i q u eo fd i cd e s i g n s p e c i f i c a l l y ，t h ea d v a n t a g eo ft h en o m a r s k ip r i s mw h i c hc a nm o v et h ep l a n eo f a p p a r e n ts p l i t t i n g ( p a s ) o u to ft h ep r i s mb yc h a n g i n gt h ep a r a m e t e ro fw o l l a s t o np r i s m i sp r e s e n t e d 7 f h e r e b yn o m a r s k ip r i s mm a k e st h a tt h ep a sc o i n c i d e sw i t ht h er e a rf o c a l p l a n eo ft h eo b j e c t i v e t h et e c h n i cc a nb eu s e di nh i g he n l a r g e m e n tr a t i om i c r o s c o p e t h ew o r k i n gp a r a m e t e r so ft h en o m a r s k ip r i s mi n c l u d i n gi t sw e d g ea n g l e ，o p t i c a la x i s i n c l i n a t i o na n g l e 。s p l i t t i n ga n g l e ，t h ed i s t a n c ef r o mt h ee x i tf a c et ot h ep a sa r e c r o s s c o r r e l a t i o n i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h ep a r a m e t e r s m a t l a bs o f t w a r ei su s e di n c a l c u l a t i n gt h er e l a t i o n a le x p r e s s i o n si n d i c a t i n g t h e p a r a m e t e r s a c c o r d i n gt o t h e p r i n c i p l e so f t h er a yp a t hc a l c u l a t i o na ne x a c ta n a l y s i so ft h ew o r k i n gp a r a m e t e r so l t h e n o m a r s k ip r i s mi nd i cm i c r o s c o p i cs y s t e ma n dt h ef o r m u l a so fd e s i g n i n gt h eo p t i c a l s y s t e m ，t h em o d e lm a t h e m a t i c so fn o m a r s k ip r i s mi sb u i l t b ya n a l y z i n gt h er e s u l t s ，a g r o u po fp a r a m e t e r so f n o m a r s k ip r i s mi sc h o s e n a tl a s t ，n o m a r s k ip r i s mi sp r o c e s s e d a n du s e di nd i 行e r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a s tm i c r o s c o p e a b o v et h i sw o r k i n g ，s o m e v a l u a b l er e s u l ti sg o ta n dt h i sw i l lb eu s e f u li np r o m o t i n gt h et e c h n i q u ei nb i o l o g i c a l c e l l sq u a n t i t a t i v em e a s u r e m e n t k e y w o r d s ：d i f f e r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a s t ，n o m a r s k ip r i s m ，p l a n eo fa p p a r e n ts p l i t t i n g ， s p li t t i n ga n g l e 溯少j 案大謦 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說明 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨立進行研究工作所取 得的研究成果。除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng) 發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方 式標(biāo)明。本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名： 掀翻墨 日期：撕7 年歲月哆日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留 并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授 權(quán)湖北工業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采 用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 學(xué)位論文作者簽名：承翟翌 日期：川年歲月日 指導(dǎo)教師鮐葉弋?dāng)U 日期：紗呷年f 月馬日 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第1 章引言 1 1 微分干涉相襯顯微術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀和應(yīng)用概況 1 6 6 5 年，r o b e rh o o k e 發(fā)明了第一臺顯微鏡，它的出現(xiàn)為人類打開了微觀世 界的大門。生物學(xué)家把顯微鏡作為一種主要工具來研究組織、器官或細(xì)胞構(gòu)造及 結(jié)構(gòu)。借助于顯微鏡，人們觀察了微小物體的結(jié)構(gòu)和特征，由此奠定了細(xì)胞學(xué)和 組織學(xué)的基礎(chǔ)，并對生物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展起到了極 大的促進作用。 光學(xué)顯微鏡從發(fā)明至今已有四百余年的歷史，經(jīng)不斷改進創(chuàng)新，為適應(yīng)生命 科學(xué)發(fā)展的需要，出現(xiàn)了各種功能的顯微鏡，如明場顯微鏡、暗場顯微鏡、偏光 顯微鏡、干涉顯微鏡、相襯顯微鏡、熒光顯微鏡等。這些顯微鏡都有其各自的優(yōu) 缺點，適用于觀察各種不同的對象。 1 9 5 2 年n o m a r s k i 發(fā)明干涉相位差光學(xué)系統(tǒng)。g n o m a r s k i 對w o l l a s t o n 棱鏡 進行了改進，使改進后棱鏡的相干平面在其外部，此種棱鏡稱n o m a r s k i 棱鏡。此項 發(fā)明不僅享有專利權(quán)并以發(fā)明者本人命名之。微分干涉相襯顯微鏡的研制成功對 生物細(xì)胞學(xué)的發(fā)展起到了一個質(zhì)的飛躍，與其它雙光束干涉顯微術(shù)相比，主要區(qū) 別在于：參加干涉的兩個光束都通過物體，光束的微小分離量是由n o m a r s k i 棱鏡 的剪切產(chǎn)生，且其分離量略小于顯微鏡的分辯極限，因而在視場中看不到干涉條 紋，通過調(diào)節(jié)n o m a r s k i 棱鏡產(chǎn)生適當(dāng)?shù)某滩?，能清晰地分辨這些透明或半透明物 體的輪廓，在視場中可以看到具有立體感的浮雕成像。 在我國由于設(shè)計和工藝加工的原因，該技術(shù)未能得到運用。清華大學(xué)、華中 科技大學(xué)以及上海光機所都對該技術(shù)做過一定的研究，雖然得出了以一些結(jié)論。 但是未能將n o m a r s k i 棱鏡加工出來。 而在德國，美國，日本等光學(xué)比較發(fā)達的國家都做出了微分干涉相襯顯微鏡， 尼康和奧林巴斯都有配套的產(chǎn)品。它們在金相、晶體、集成電路、光學(xué)、陶瓷工 藝等眾多的領(lǐng)域發(fā)揮了重大的作用，該技術(shù)己成為國內(nèi)外普遍使用的一種最有效 的光學(xué)顯微技術(shù)。 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對生物體的觀察測量問題提出了更高的要求，如蛋白質(zhì) 生長過程監(jiān)測、植物胚胎結(jié)構(gòu)觀察等n 。2 1 。但是由于生物體本身是透明體，同時質(zhì) 地柔軟，所以使測量過程變得復(fù)雜化。由于透明體對光只產(chǎn)生相位的移動而不能顯 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論丈 著地改變光的振幅，所以使其圖像住一般的光學(xué)儀器中不能被人眼觀察，而需要對 樣品進行處理，比如染色等才能進行觀察。但是由于這些處理過程也會相應(yīng)的對樣 品有一定的影響，比如染色可能會引起生物的中毒，囚此不能在生物的體內(nèi)應(yīng)用。 因此在生物體的測量中，非染色的光學(xué)測量方法就非常重要了1 。 微分相襯干涉顯微術(shù)具有其它光學(xué)顯微術(shù)所不能達到的某些優(yōu)越性能。其不 僅具有納米級的相位分辨率，可看到一般光學(xué)顯微鏡難以觀察到的微細(xì)結(jié)構(gòu)，而且 還能使被觀察樣品的像具有很強的立體感h 1 。微分相襯干涉顯微術(shù)中的關(guān)鍵技術(shù) 是n o m a r s k i 棱鏡設(shè)計。n o m a r s k i 棱鏡除了運用于微分相襯干涉顯微鏡中進行觀 察和定量測量，還廣泛運用于其他檢測設(shè)備：如在c o u r t i a l 設(shè)計的f o u r i o r 光譜 儀中測量波長瞄1 等。 在機械構(gòu)造方面，可以采用現(xiàn)有的筒長無限的光學(xué)系統(tǒng)，這種光學(xué)系統(tǒng)中問 是平行光。而n o m a r s k i 的主要功能零件是n o m a r s k i 棱鏡和起偏器、檢偏器等所 組成。如果通過適當(dāng)?shù)脑O(shè)計，把這些部件插入光學(xué)系統(tǒng)為筒長無限的顯微鏡光路中， 就成為微分干涉相襯顯微鏡了。這樣不僅原光路中的物鏡能通用，甚至諸如目鏡、 聚光鏡等也能通用了。 基于上述一些優(yōu)點，該顯微術(shù)已廣泛用于有機物和無機物的顯微觀察，國外 一些擅長生產(chǎn)顯微鏡的國家如西德早已在普通顯微鏡、偏光顯微鏡、倒置顯微鏡 甚至在比較顯微鏡上都配有這種微分干涉相襯裝置，以供選用。 下面將概述它在不同領(lǐng)域中的適用性。 1 用于有機物觀察 在細(xì)胞學(xué)方面。當(dāng)使用相襯方法由于光暈效果不可能辨認(rèn)出細(xì)節(jié)時例如婦科 細(xì)胞檢查中的細(xì)胞邊界和紅血球的觀察都會出現(xiàn)討厭的光暈現(xiàn)象，用微分干涉相 襯法就能清晰而真實地體現(xiàn)出來 在植物學(xué)方面，它需要景深較淺的顯微術(shù)，而微分干涉相襯法正好符合這一要 求，它可顯示植物細(xì)胞分裂時的軸纖維，而用其它顯微術(shù)幾乎是不明顯的。 在組織學(xué)方面，它也能使用染色標(biāo)本，從而能容易地檢測出人的染色體，這要 比用普通明視場顯微觀察來得快速和方便多1 。 在血液學(xué)方面，它能使未染色的紅血球呈現(xiàn)出優(yōu)良的像質(zhì)，而這在相襯中由 于嚴(yán)重的光暈是不可能的。 在神經(jīng)學(xué)方面，它可以觀察到人體神經(jīng)節(jié)細(xì)胞業(yè)特別適合檢查所謂反饋神經(jīng) 細(xì)胞。 在細(xì)菌學(xué)方面，如用相襯方法來觀察細(xì)菌標(biāo)本，則像的質(zhì)量會因光暈而變差， 這時用微分干涉相襯法就會表現(xiàn)其顯著的優(yōu)點n 1 。 2 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 在流體生物學(xué)方面，例如對硅藻的觀察，它要比普通明視場和相襯觀察優(yōu)越， 能給出細(xì)節(jié)豐富的三維像。 2 用于無機物觀察 在金相學(xué)方面，它能顯現(xiàn)出普通明視場顯微術(shù)所不能辨認(rèn)的滑移帶，以氯化 鈉晶體為例，用明視場顯微術(shù)僅能見到晶體的外形而在相襯像中，因大部份被光 暈所掩蓋，也不清晰，然而在微分干涉相襯像中，則很清晰。此外對于碳化硅上的 生長螺線、第二次重結(jié)晶時的螺線等檢查也具有明顯的優(yōu)點 在半導(dǎo)體工藝學(xué)方面，它能完全適合硅單晶的檢查。如果適當(dāng)?shù)匚g刻標(biāo)本，則 雜質(zhì)的不均勻性等也能被觀察出。 在礦物學(xué)方面，它能以彩色相襯形式顯出顯微硬度凹痕周圍的破裂和凸出部 分。 在玻璃工藝學(xué)方面，它能看清玻璃表面上的微小細(xì)節(jié)，這點要比其它顯微術(shù) 優(yōu)越。 在塑料方面，它能以彩色相襯形式顯出在普通明視場顯微像中看不見的顯微 硬度壓痕。 綜上所述，微分干涉相襯顯微術(shù)的適用范圍是很廣的，只是目前在我國還不夠 普及和未被人們廣泛地了解而己，如果能在設(shè)計、工藝上突破，加以宣傳，則該顯 微術(shù)必定會受到各個行業(yè)的歡迎陋1 。 1 2 選題依據(jù)及研究目的 本課題來源于國家自然科學(xué)基金項目“微分干涉相襯層析顯微術(shù)的研究 。 雖然n o m a r s k i 棱鏡多年前就已經(jīng)被提出并以得到廣泛的應(yīng)用，但國內(nèi)有關(guān)具 體參數(shù)的設(shè)計計算的公開資料不多。文獻資料雖然對微分干涉相襯顯微鏡中的 n o m a r s k i 棱鏡參數(shù)做了相關(guān)的分析。但最后都沒有得出一個具體的結(jié)果，未將其 運用到光學(xué)系統(tǒng)中去。后續(xù)的機械構(gòu)件設(shè)計、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整、加工工藝都是一 個復(fù)雜的過程。 本課題在分析n o m a r s k i 棱鏡各個參數(shù)關(guān)系的基礎(chǔ)上，根據(jù)相干平面與系統(tǒng)物 鏡焦面重合且入射光線和相干面垂直的準(zhǔn)則設(shè)計出了符合該光學(xué)系統(tǒng)的 n o m a r s k i 棱鏡，并按照加工工藝加工出棱鏡，最后設(shè)計加工機械結(jié)構(gòu)。在對光學(xué) 系統(tǒng)進行調(diào)整之后，能夠達到一定的觀察效果。 3 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 3 本論文所做的工作與內(nèi)容安排 微分干涉相襯顯微關(guān)鍵技術(shù)主要是n o m a r s k i 偏振分光棱鏡設(shè)計及系統(tǒng)中各 元件光軸間正確位置的確定。 為了最終設(shè)計出滿足試驗觀察需要的顯微鏡裝置，就必須對n o m a r s k i 棱鏡的 一些主要設(shè)計參數(shù)如楔塊楔角、光軸傾角、分束角、相干平面出離量等，得出一 系列數(shù)值解的分布和變化規(guī)律。本文基于這些參數(shù)變化規(guī)律，對n o m a r s k i 棱鏡光 學(xué)系統(tǒng)的計算公式進行了詳細(xì)的推導(dǎo)，并運用m a t l a b 軟件自編程序并結(jié)合本顯微 鏡光學(xué)系統(tǒng)做了具體的設(shè)計實例。在此基礎(chǔ)上加工出了棱鏡，并設(shè)計了夾具等機 械構(gòu)件。最后對光學(xué)系統(tǒng)進行調(diào)整，得出了實驗結(jié)果。 全文內(nèi)容的安排： 第一章，緒論。介紹生物體光學(xué)顯微觀察測量技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用概況，并對 相關(guān)的幾種測量方法進行比較。說明了本論文所要做的工作。 第二章，介紹了微分干涉相襯顯微鏡的基本原理，以及整個光學(xué)系統(tǒng)及機械 構(gòu)件的組成。 第三章，利用光線追蹤法，對n o m a r s k i 棱鏡主要設(shè)計參數(shù)：楔塊楔角y 、棱 鏡厚度a 、光軸傾角6 、相干平面出離量d 進行了嚴(yán)格的數(shù)學(xué)推導(dǎo)，得出各參數(shù) 的計算公式，通過有關(guān)m a t l a b 程序的計算分析了各參數(shù)之間的關(guān)系，完成了 n o r m a s k i 棱鏡的整體設(shè)計框。 第四章，結(jié)合已有的光學(xué)系統(tǒng)，給出了設(shè)計實例，分析得出了實驗結(jié)果。 第五章，微分干涉相襯顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)建。通過n o m a r s k i 棱鏡材料的檢 測試驗，選取了合適的材料并設(shè)定了相應(yīng)的棱鏡基本光學(xué)參數(shù)。最后構(gòu)建了微分 干涉相襯顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)試驗裝置。 第六章，全文總結(jié)與展望。 4 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第2 章顯微系統(tǒng)的基本原理 2 1 幾種不同光學(xué)顯微方法的比較 目前應(yīng)用于生物學(xué)觀察的光學(xué)顯微技術(shù)除了常用的明視場技術(shù)和暗視場技術(shù) 以外，還有偏光顯微術(shù)、相襯顯微術(shù)、微分干涉相襯顯微技術(shù)等，下面對有關(guān)幾 種進行介紹并加以比較。 2 1 1 偏光顯微術(shù) 偏光顯微術(shù)是利用偏振光對樣品進行各向異性即雙折射性能檢測的顯微技 術(shù)。將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射( 各向同 行) 或雙折射性( 各向異性) 。雙折射性是晶體的基本特性。因此，偏光顯微鏡被 廣泛地應(yīng)用在礦物、化學(xué)等領(lǐng)域，在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用。偏光顯微術(shù)的原 理如下引。 jl 巫程差 di n 。 l 鼉 i 雙折射物體 光軸 圖2 1 雙折射物體的偏光干涉 莛毳 露簦 干 涉 象 一 l 一 j j _ ，一 _ - ， 、- 、 1r r 一 一 圖2 2 偏光顯微術(shù)光學(xué)原理 5 檢偏鏡 湖北5 - 業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 如圖2 1 所示，線偏振光透射到具有雙折射性質(zhì)的物體中，分解成互相垂直 的兩束光，因其折射率不同，光束有超前和推遲之別，隨物體的厚度加劇，光程 差又為物體雙折射性和厚度的乘積，經(jīng)過檢偏鏡將尋常光( 0 光) 和非常光( e 光) 聚合而形成合成波，產(chǎn)生干涉色。如圖2 2 所示，偏光顯微鏡只需在光源和聚光 鏡之間加一塊起偏鏡，在物鏡和目鏡之間的鏡筒內(nèi)放一塊檢偏鏡就可以實現(xiàn)n 叭。 總結(jié)偏光顯微術(shù)的優(yōu)點如下： ( 1 ) 結(jié)構(gòu)簡單，容易由般顯微鏡改裝。 ( 2 ) 對各向異性物體的觀察具有顯著的優(yōu)勢，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的用途。 偏光顯微術(shù)的缺點如下： ( 1 ) 應(yīng)用范圍相對比較狹窄，只適用于具有雙折射性的物質(zhì)。 ( 2 ) 沒有涉及光學(xué)顯微系統(tǒng)在相位變化方面分辨力的提高。 2 1 2 相襯顯微術(shù) 相襯顯微術(shù)是利用衍射和干涉現(xiàn)象，把位相差改變?yōu)檎穹?，即把光程差?變?yōu)槊靼挡畹娘@微方法。 若被檢測物與其周圍介質(zhì)具有相同的吸收系數(shù)和顏色，只在折射率上有微小 的差別，此時用一般顯微鏡觀測這些物體非常困難。為此常將被檢測物染色，但 是這種方法對有機體的生命有害，甚至使有生命的被檢物死亡。相襯顯微術(shù)對上 述矛盾給出了一個解決辦法，它是由荷蘭物理學(xué)家z e r n i k e 首先提出的，其原理 如下1 。 如圖2 3 所示，有一塊透明的平行板，其折射率在中間一小部分為偽，而其 周圍部分為，l 。以波長為九的相干平行光直射，透過該平板后，由于中間小板部 分與周圍部分的影響，該光束的波動方程分別為： y l = 口c o s ( w t + 6 ) ( 2 1 ) y ：a c o sc o t ( 2 2 ) 式中，a 為振幅 6 為光線l 、2 透過平板后的位相差，6 ；孚d ( ? l - - n i ) d 為平板的厚度 將透過小板的光線2 的波動方程分解得 y l ：口c 。s + 6 ) ：口【c o s t - i t 一2 s i n 萼s i n + 萼) 】 6 湖北5 - - 業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 + 鍘n 爭缸+ 蘭+ 乏) 州y ( 2 - 3 ) l h 上式可見，通過小板的光可以分為兩部分，一部分稱為直射光，其波動方 程為y ，另一部分為衍射光，其波動方程為y 。綜合式( 2 一1 ) 和式( 2 - 2 ) t ，可以認(rèn) 為相干光束通過整個平板后分成兩部分：一部分是通過整個平板( 包括小板) 的直 射光，另一部分僅由小板引起的衍射光n 2 。1 引。相應(yīng)的波動方程為： y y = ；口2 口c o 。s i n t d 蘭f s 。n 玎+ 喜+ 三， ( 2 4 ) 通過小板a 點的兩束光經(jīng)顯微鏡物鏡后在象平面成a 點象( 圖2 4 a ) ，其振幅為 口2 。礦+ 4 a 2 s i n 2t 5 + 4 a 2 s i n 魚c o s + ：口2( 2 5 ) 22、22 7 而直射光所達到象平面上各點振幅為口，顯然它們的亮度相同，襯度 尼；堡三譬；0 ，在象平面上無法區(qū)別小板及其周圍介質(zhì)。 l l r r 2l 1 l 圖2 3 相干光通過透明平行平板 7 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 j j s a一 r 多 1 ，而大部分不通過相板沒有影響，故衍 射光的波動方程由兩部分組成，式( 2 4 ) 可以表達為 仁 = 等a c o 叫s q a - 6 , 刪) 寺堿1 2 a 幽扣+ 妻4 ， ( 2 _ 6 ) k 等冽n 差c o s 缸寺爭訂s i n 罷c o s 印+ 籠枷 由于n 1 ，所以衍射光可以近似表示為y = 2 a s i n 蘭c 。s + 吾+ 三) 。 此時小板象中心a 點合成振幅為 口2 = 口2 1 + 4 s i n 2 罷+ 4 s i n 害c o s ( 耋+ 三+ 6 。) 】( 2 - 7 ) 其襯度為 8 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 七：等；一4 s i n 要【s i n 要一s i n ( 要+ 6 ，) 】( 2 - 8 ) 口二二z 適當(dāng)選取桐板的厚度及材料( 折射率) ，可以使得a 點的襯度為極值，即有 k 。= 2 6 ( 2 - 9 ) 顯然，此時小板的形狀在顯微鏡下可以分辨。采用相板使得人的眼睛能感受物體 折射率的微小差別( 體現(xiàn)在光程差上) 。通常人眼能感受的最小襯度k ：o 0 2 ，即 有2 6 ：0 0 2 。在白光下折算成光程差為： f 皇0 0 0 1 p r o ( 2 1 0 ) 即只要物體各部分有0 0 0 1 p r o 的光程差，人眼就能感受到。 總結(jié)相襯顯微術(shù)的優(yōu)點如下： ( 1 ) 觀察樣品無需染色，避免了其他方法對樣品機能的影響，是觀察不吸收光的 透明活體細(xì)胞或組織的有效辦法n 引。 ( 2 ) 結(jié)構(gòu)比較簡單，可以由明視場顯微鏡換上萬能聚光鏡和相襯物鏡改裝，適合 一般實驗室的定性觀察n 5 1 。 ( 3 ) 提高了光學(xué)顯微系統(tǒng)在微j , n 位變化方面的分辨能力。 相襯顯微術(shù)的缺點如下： ( 1 ) 相襯顯微鏡在相襯像形成的過程中，由于發(fā)生在具有不同光程區(qū)域邊緣上的 衍射會帶來光暈效應(yīng)和漸暗效應(yīng)n 6 l 。 ( 2 ) 由于上述效應(yīng)使得實現(xiàn)定量測量產(chǎn)生困難。 2 1 3 微分干涉相襯顯微術(shù) 微分干涉相襯顯微術(shù)是一種利用偏振光干涉原理，顯微鏡分辨極限以下的波 面剪切干涉技術(shù)。主要有兩組偏振光片和偏振分光棱鏡( w o l l a s t o n 棱鏡或 n o m a r s k i 棱鏡) 組成。偏振分光棱鏡有兩塊三角形的棱鏡膠合而成，它可把單一 的一束偏振光線分開，形成振動方向互相垂直的兩束偏振光線。兩個微分光線把 樣品表面微觀起伏的高度變化以光強和干涉色的形式表現(xiàn)出來，具有強烈的立體 感。 微分干涉相襯顯微鏡本質(zhì)上也是一種雙光束干涉顯微鏡，與其它雙光束干涉 顯微鏡的主要區(qū)別在于，它采用了共光路干涉原理，即它的兩支相干光幾乎重疊 在一起而經(jīng)過相同的光路，因此對外界干擾如機械振動、空氣擾動、溫度起伏等 對它們的影響相同，不會引起附加的光程差，因此外界環(huán)境的變化對測量結(jié)果無 9 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 影響。并且它不需要參考面，適合在生產(chǎn)環(huán)境中使用n 7 1 。 微分干涉相襯顯微術(shù)和相襯顯微法相似，是用以觀察未染色不吸收光的透明 活體細(xì)胞或組織的有效辦法。主要優(yōu)點有： ( 1 ) 微分干涉相襯能將樣品的光學(xué)厚度梯度如實的反映出來，形成其他顯微 術(shù)所沒有的三維立體浮雕圖象，而且細(xì)節(jié)的輪廓清晰n 引。 ( 2 ) 極大地提高了光學(xué)顯微鏡相位分辨能力，可以觀察到納米級相位變化。 ( 3 ) 對樣品的適應(yīng)性較廣，無論樣品厚與薄，折射率相差是否大，染色與否， 是否活體等，均能觀烈1 9 1 。 ( 4 ) 對外界環(huán)境的要求較低。 微分干涉相襯顯微術(shù)的缺點有： ( 1 ) 偏光棱鏡設(shè)計、加工都比較復(fù)雜，光學(xué)系統(tǒng)中各元件光軸間正確位置確 定困難。 ( 2 ) 一般都認(rèn)為微分干涉相襯顯微測量方法只適用于定性觀察，而不能實現(xiàn) 定量測量乜1 。2 羽。 2 2 微分干涉相襯顯微鏡的基本原理 2 2 1 線偏振光干涉原理 根據(jù)光的干涉原理，兩束光波只有在頻率相同、位相差穩(wěn)定、振動方向一致 時才會產(chǎn)生干涉現(xiàn)象。一束線偏振光進入晶體后，分解成振動方向相互垂直的兩 束線偏振光，由于它們具有不同的傳播速度，因此它們之間就產(chǎn)生位相差( 或光程 差) ，位相差( 或光程差) 的大小取決于兩束光的折射率以及在晶體內(nèi)的傳播距離。 如果在出射光路中插入一塊偏振鏡，這樣可將兩個具有一定位相差，振動方向相 互垂直的出射光波引導(dǎo)到同一偏振方向，從而實現(xiàn)了干涉，即光強隨位相差變化 的現(xiàn)象比引。 在研究偏振光干涉時，經(jīng)常要用到兩塊偏光鏡，一塊稱為起偏鏡，用以產(chǎn)生 線偏振光，另一塊稱為檢偏鏡，它可以引導(dǎo)兩個互相垂直并具有一定位相差的線 偏振光在同一偏振面內(nèi)產(chǎn)生干涉。由起偏鏡產(chǎn)生的同一偏振光通過單軸晶體所產(chǎn) 生的兩束偏振光是可能相干的。只要用檢偏鏡把光振動面都投影到同一平面上， 兩束光就會發(fā)生干涉乜鍆。 下面具體分析平行光束在有起偏鏡和檢偏鏡的情況下，通過晶體后產(chǎn)生的干 涉現(xiàn)象。參考圖2 5 ，圖2 6 ： 1 0 湖北5 - 業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 y s 圖2 5 平行光偏光干涉裝置 觀 察 屏 圖2 6 光波振動分量的分解 一束單色平面光波( 波長a ) 通過起偏鏡p 變成線偏振光波，垂直投射到晶體 上，在晶體中將被分解成振動方向相互垂直的兩束光波，傳播速度快光波的稱為 快波，相應(yīng)的偏振方向稱為快軸方向( 圖2 6x 軸方向) ，傳播速度慢光波的稱為 慢波，相應(yīng)的偏振方向稱為慢軸方向( 圖2 6y 軸方向) 。如果投射到晶體中的沿 起偏鏡p 方向振動的偏振振幅為a ，則沿快軸方向及慢軸方向的振幅分別為： a ，2 a 。c o s a( 2 1 1 ) l a j a o s i n a 式中a 是起偏鏡的透光軸與快軸的夾角。若晶體的厚度為口，則光通過晶體 后，快波和慢波之間的光程差r 和位相差6 分別為瞳引： f = ( ，l ，一n ，) 口 ( 2 1 2 ) q 鏡一| 偏一一 籬 h h p 7 i鏡一i 偏一一 起弋 一 光 一 行 一 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 6 = 百2 z ( 九，一n ，( 2 - 1 3 ) 設(shè)起偏鏡與檢偏鏡透光軸之間的夾角為盧，則上述兩偏振光在檢偏鏡透光軸 方向的振幅分別為 j o f - - a o c o s a c o s ( a 一盧 ( 2 1 4 ) i o s = a os i n a s i n ( a 一盧) 由于它們之間的頻率相同，振動方向相同，位相差恒定，所以滿足相干條件， 疊加后產(chǎn)生的偏振光干涉光強可用下面公式描述： ，= ，l + ，2 + 2 ，l ，2c o s 6 ( 2 1 5 ) 式中，、，2 分別為 j ，- 2a ；c 。s 2 口c o s 2 一盧( 2 - 1 6 ) l ，2 3 0 2s i n 2a s i n 2 一盧) 代入上式得到通過檢偏鏡的光強 j r ；a 2 c o s 2 盧一s i n2 a s i n2 ( a p ) s i n2 要】 ( 2 1 7 ) 為了將問題簡化，使得干涉后的光強度達到極值，對a 和盧角的值作如下選 擇2 6 1 ： ( 1 ) 盧角取為零度，則起偏鏡與檢偏鏡的透光軸平行，此時式( 2 1 7 ) 成為： ，。智( 1 “n 22 a s i n z 要) ( 2 - 1 8 ) 若a 取0 0 ，9 0 0 或1 8 0 0 ，光強度達到極值，但起偏鏡與n o m a r s k i 棱鏡的這 種相對位置將使得光在棱鏡中不發(fā)生雙折射，也就不會形成微分干涉相襯象。若a 取4 5 0 或1 3 5 0 ，雖可形成微分干涉相襯象但是光強為極小。a 取上述值以外的其 他值，則情況介于二者之間。因此實用上通常不取盧角為零度。 ( 2 ) p 角取為9 0 。，則起偏鏡與檢偏鏡的透光軸正交，此時式( 2 1 7 ) 成為： ，：3 0 2s i n 缸s i l l 2 要 ( 2 一1 9 ) 若a 取0 。，9 0 。或1 8 0 。，棱鏡不發(fā)生雙折射，且i = o ，為極小值。視場處于全暗的 消光位置。若口取4 5 。或1 3 5 。，棱鏡發(fā)生雙折射，目光強為極大，式( 2 一1 9 ) 成為 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 ，卅s i n 2 寶 此時，象面上各點的光強僅取決于兩束偏振光的位相差。 偏鏡正交，且其透光軸與快軸夾角為4 5 。或1 3 5 。是可取的。 2 2 2 線偏振光微分原理 ( 2 2 0 ) 因此，起偏鏡與檢 光源的甲行光線先通過起偏器變成線偏振光，通過半反半透鏡到達r o m s k i 棱鏡，在棱鏡里分成了互相垂直的兩束先偏振光即0 光和e 光，它們的振動方向相 互垂直，傳播方向一致，一個為非常光e ，折射率為n e ，另一個為尋常光0 ，其折射率 為n o 當(dāng)e 光、0 光進入膠合面時，即分裂成兩束具有某夾角的線偏振光，且折射時 e 光、o 光相互對換，最后從棱鏡下半部折射出的光為發(fā)散的兩束光，射向物鏡，這 個發(fā)散光束的夾角稱分束角，發(fā)散光束的會聚平面稱相干平面，通常在棱鏡的內(nèi) 部。n o m a r s k i 棱鏡的特點就是分束角特別小，小到小于顯微鏡的分辨率角，因而 被稱為“微分”。發(fā)射光束離開棱鏡表面后會聚，會聚平面稱為相干平面心7 1 。 從幾何光學(xué)的觀點來講，兩束光分別從樣品上的兩點通過，應(yīng)該在目鏡的視 場里形成雙像。但是由于兩束光的橫向剪切量小于顯微鏡的極限分辨率，因此在 視場中看不到雙像，而在圖像的一側(cè)可以隱約看到另一像的陰影，產(chǎn)生了浮雕感。 浮雕感產(chǎn)生的方向與光線分開方向一致。 如圖2 5 所示，若一厚度為d 的樣品，其細(xì)節(jié)a 的折射率小于其周圍b 的折 射率，那么由n o m a r s k i 棱鏡所分裂出來的兩束位相差為6 。的光線通過該樣品后 波面發(fā)生變化，并產(chǎn)生橫向位移。兩個光束在通過厚度均為d 的細(xì)節(jié)a ( 或周 t 圍b ) 時沒有產(chǎn)生新的光程差，即兩束光的位相差不變，仍然為u 0 ，所以干涉色 不變。但是在通過細(xì)節(jié)交界處c l ( 或c 2 ) 時，產(chǎn)生了新的光程差，即兩束光間的位 相差改變?yōu)閐 1 ( 或d 2 ) 。所以在細(xì)節(jié)的邊緣產(chǎn)生了不同的干涉色，因而加強了襯 度與浮雕感。 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 個個個個 圖2 7 光線通過樣品后波面變化示意圖 2 2 3 光學(xué)系統(tǒng)原理 聚 ( a ) 反射式 1 4 鏡 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 棱鏡移動方向 l l _ k ?l i l， l 一 l 檢偏鏡 n o m a r s k i 棱鏡 物鏡 樣品 聚光鏡 n o m a r s k i 棱鏡 起偏鏡 ( b ) 透射式 圖2 8 典型的微分干涉相襯顯微鏡系統(tǒng) 由以上光學(xué)系統(tǒng)可知，物鏡的后焦面應(yīng)與復(fù)合光的相干平面重合，要求物鏡的 焦距足夠長，對于高放大倍率物鏡很難做到。所以將w o l l a s t o n 棱鏡中原來垂直于 棱鏡短邊的光軸傾斜成某一角度6 。改變6 值從而改變其他參數(shù)，使其符合光學(xué) 系統(tǒng)的需要。最終將w o l l a s t o n 棱鏡的相干面移到了棱鏡的外部。 綜上所述，在微分干涉相襯顯微鏡中要使物體產(chǎn)生具有三維立體感的浮雕像， 必須具備下列條件呦1 ： ( 1 ) 由n o m a r s k i 棱鏡使兩束光波形成一個橫向剪切量，此量應(yīng)小于顯微鏡物 鏡的分辨率，兩束光波經(jīng)過物體樣品，物鏡，n o m a r s k i 棱鏡后，將樣品中橫向分 離值的光學(xué)梯度以光強襯比形式體現(xiàn)出來，使它成為可見。 ( 2 ) 兩束光波從樣品反射經(jīng)過n o m a r s k i 棱鏡在縱向產(chǎn)生一個合適的光程差， 即兩束光波各自形成的像在縱向有一個合適的分離，以便物體樣品上縱向厚度也 以光強襯比形式體現(xiàn)，使得像元上出現(xiàn)陰暗效果，對像起到襯托作用。 ( 3 ) n o m a r s k i 棱鏡的相干面必須與物鏡的后焦面重合。 湖北i 業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 3 機械機構(gòu) 圖2 9 改裝后的顯微鏡 t 圖是本文改裝后的微分二f 涉相襯顯微鏡的實物圖，它主要包括： f 1 ) 機械裝置 顯微鏡的基本機械裝置，其作用是固定與調(diào)節(jié)光學(xué)鏡頭，固定與移動標(biāo)本等。 主要有鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、與調(diào)焦裝置組成。 鏡座和鏡臂 1 、鏡座；作用是支撐整個顯微鏡。 2 、鏡臂：作用是支撐鏡筒和載物臺。 載物臺( 又稱工作臺、鏡臺) 載物臺作用是安放載玻片，形狀有圓形和方形兩種，其中方形的面積為 1 9 0 i n m x l 4 0 m m 。移動范圍是7 8 m m x 5 5 m m 。中心有一個通光孔，通光孔后方左 右兩側(cè)各有一個安裝壓片夾用的小孔。 鏡筒 鏡筒上端放置目鏡，下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器。機械筒長( 從目鏡管上緣到物鏡 轉(zhuǎn)換器螺旋口下端的距離稱為鏡筒長度或機械簡長) 1 6 0 m m 。 安裝目鏡的鏡筒，是雙筒顯微鏡，兩眼可同時觀察以減輕眼睛的疲勞。積筒 之間的距離可毗調(diào)節(jié)，而且其中有一個目鏡有屈光度調(diào)節(jié)( 即視力調(diào)節(jié)) 裝置， 便于兩眼視力不同的觀察者使用。 湖北i 業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 物鏡轉(zhuǎn)換器 物鏡轉(zhuǎn)換器固定在鏡筒下端，有3 4 個物鏡螺旋口，物鏡應(yīng)按放大倍數(shù)高低 順j f 排州。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器時，應(yīng)用手指捏住旋轉(zhuǎn)碟旋轉(zhuǎn)，不要用手指推動物鏡， 閑時間長容易使光軸歪斜，使成像質(zhì)量邊壞。 調(diào)焦裝置 顯微鏡上裝有粗準(zhǔn)焦螺旋和細(xì)準(zhǔn)焦螺旋。顯微鏡粗準(zhǔn)焦螺旋與裝在同軸卜， 大螺旋為粗準(zhǔn)焦螺旋，小螺旋為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋。粗準(zhǔn)焦螺旋行程2 5 r a m ，細(xì)準(zhǔn)焦螺 旋每回02 r a m ，微調(diào)格值2 “m 。 ( 2 ) 光學(xué)系統(tǒng) 該顯微鏡原足一臺光學(xué)系統(tǒng)無限遠(yuǎn)色差校正光學(xué)系統(tǒng)，取l o x 無限遠(yuǎn)消色差 物鏡，物鏡焦距f = 87 1 9 ，數(shù)值孔徑n a - 02 5 ，目鏡為i o x 大視野、高眼點平 場目鏡，視場數(shù)為妒2 0 m m 。 ( 3 ) 加裝的機械構(gòu)件 為了加裝起偏器、檢偏器以及n o m a r s k i 棱鏡。必須在合適的位置進行機械加 工。如圖21 0 和2 1 l 是安裝超偏器和撿偏器的位置。按照前面的干涉理論分析 分析，起偏鏡與榆偏鏡正交，且其透光軸夾角為4 5 0 或1 3 5 。時，兩個折射光具有 相同的強度且干涉光強也最大。所以采用下圖的安裝方法，在具體使用時還要調(diào) 整起偏鏡與檢偏鏡頭光軸的夾角。 圖2 1 0 起偏器加裝的位置圖圖21 1 檢偏器加裝的位置圖 圖21 2n o m a r s k l 棱鏡夾具的安裝圖2 1 3n o m a r s k i 棱鏡夾具 其中n o m a r s k i 棱鏡的夾具設(shè)計是關(guān)鍵。夾具必須滿足可以裝夾n o m a r s k l 棱 鏡而且可調(diào)整棱鏡的位置，以使n o m a r s k i 相干面和物鏡的后焦面重合的要求。 在夾具的兩端加工有螺紋連接，一邊連接鏡筒，一邊連接物鏡。在夾具的中 間加工出一道可以安裝n o m a r s k i 棱鏡的小口，其傾斜度必嚴(yán)格滿足棱鏡的安裝要 求，才能保證入射角的角度，使其與相干面n o m a r s k i 棱鏡垂直。同時該夾具可以 自由調(diào)整高度，以足n o m a r s k i 棱鏡的相干面與物鏡的后焦面重合的原則。 湖北5 - - 業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第3 章n o m a rs ki 棱鏡的設(shè)計基礎(chǔ) 3 1n o m a r s ki 棱鏡各參數(shù)的推導(dǎo) n o m a r s k i 棱鏡由兩塊單軸晶體偏振分光材料三角楔塊膠合組成，兩個楔塊的 光軸在空問上相互垂直。其中一個楔塊的光軸垂直于包含有棱鏡內(nèi)部界面法線的 入射平面，另一楔塊的光軸位于入射面內(nèi)并且與棱鏡的入射和出射面形成一定的 傾斜角。如圖3 3 所示，在這里把外界面和另一楔塊的光軸之間的夾角稱為光軸 傾角6 。把外界面和中間界面之間的夾角稱為楔塊楔角y 。 n o m a r s k i 棱鏡主要設(shè)計參數(shù)有：楔塊楔角、棱鏡厚度、光軸傾角等參數(shù)決定 了出射的非常光與尋常光之間的交角e ( 稱為分束角) 、相干平面位置及相干平面 與系統(tǒng)光軸之間的交角、光程差等。這些參數(shù)對微分干涉相襯光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計 是很重要的啪1 。 3 1 1 分束角的設(shè)計計算 考慮到所有入射平面都有可能，這里假設(shè)所有的光波向量和傳播方向始終保 持在包含有棱鏡內(nèi)部分界面法線( 如圖3 1 和圖3 2 所示) 的入射平面上。如下 面的圖3 3 所示，在此只取光線先經(jīng)過光軸與入射面共面楔塊，再從另一光軸與 入射面垂直楔塊的情況來討論卜3 2 1 ( 其他情況可用同樣方法得出) 。 囂i ，。廚 ( c ) ( d ) 圖3 1 偏振光通過w o l l a s t o n 棱鏡 1 9 曠豫型 一t ，一 匿 湖北工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 o 亂一 7 ， 弛o ； f ； e ：型l 一 一 o 土 ( d ) ； 。彥 “ ( c ) ( d ) 圖3 2 偏振光通過n o m a r s k i 棱鏡 設(shè)線偏振光以入射角口入射到棱鏡，楔塊楔角為，尋常光在棱鏡中的折射 率為n 。，非常光在棱鏡中最小的主折射率為n 。棱鏡的三個分界面把棱鏡分為1 、 2 、3 、4 區(qū)，其中入射角為a 。如圖3 3 所示入射的線偏振光可分為振動方向垂 直于紙面和平行于紙面的兩束光。各個參數(shù)如圖3 3 所示。 圖3 3 線偏振光入射n o m a r