jflflll rfi ii i l l f l l l l l y 17 9 9 7 8 1 華中農(nóng)業(yè)大學學位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權書 學位論文 否如需保密，解密時間年月日 是否保密 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成 果盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā) 表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學或其他教育機構的學位或證書 而使用過的材料，指導教師對此進行了審定與我一同工作的同志對本研究所做的任 何貢獻均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意 研究生簽名：凌 j 醋時間：多嘞年r 月，多日 學位論文使用授權書 本人完全了解華中農(nóng)業(yè)大學關于保存、使用學位論文的規(guī)定，印學生必須按照學 校要求提交學位論文的印刷本和電子版本；學校有權保存提交論文的印刷版和電子版， 并提供目錄檢索和閱覽服務，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存，匯編學位 論文本人同意華中農(nóng)業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全 部或部分內(nèi)容，同時本人保留在其他媒體發(fā)表論文的權力 注：保密學位論文( 印涉及技術秘密，商業(yè)秘密或申請專利等潛在器要提交保密的論 文) 在解密后適用于本授權書 學位敝作者撓憾 導臌：囪砌 腳飆膨川鈿柳p 口付刖7 日 注：請將本表直接裝訂在學位論文的扉頁和目錄之間 苦瓜單倍體誘導的初步研究 目錄 摘要1 a b s t r a c t 2 縮略語表4 l 前言5 1 1 課題的提出5 1 2 國內(nèi)外研究進展7 1 2 1 供體植株的基因型1 1 1 2 2 接種時未受精子房和胚珠的發(fā)育時期( 胚囊成熟度) 1 1 1 2 3 培養(yǎng)基對未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的影響1 2 1 2 4 培養(yǎng)條件對未受精子房和胚珠的影響1 4 1 2 5 供體植株的生理狀態(tài)對未受精子房和胚珠的影響1 5 1 2 6 單倍體植株倍性鑒定方法1 5 1 2 7 再生胚囊植株的倍性水平。1 6 1 2 8 單倍體植株加倍的研究。16 2 本論文研究目的和內(nèi)容1 7 3 材料與方法18 3 1 材料。18 3 2 方法18 3 2 1 苦瓜花粉滅活處理1 8 3 2 2 花粉活力檢測1 9 3 2 3利用葫蘆科近緣屬花粉對苦瓜雌花進行蒙導法處理1 9 3 2 4甲苯胺藍、馬來酰肼、二甲基亞砜處理苦瓜雌花1 9 3 2 5 苦瓜未受精胚珠的準備1 9 3 2 6 接種外植體的滅菌準備2 0 3 2 7 苦瓜處理后子房在不同激素和添加劑配比下的誘導培養(yǎng)2 0 3 2 8 苦瓜未受精胚珠的預培養(yǎng)2 1 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 3 2 9 苦瓜未受精胚珠的在不同激素和添加劑配比的誘導培養(yǎng)2 l 3 2 1 0 數(shù)據(jù)處理一2 1 4 結果與分析2 4 4 1 苦瓜花粉滅活處理結果2 4 4 2 葫蘆科近緣屬花粉對苦瓜雌花進行蒙導處理結果分析2 9 4 3 甲苯胺藍、馬來酰肼、二甲基亞砜處理苦瓜雌花結果分析3 3 4 4 外植體滅菌處理結果3 7 4 5 苦瓜處理后子房在不同激素和添加劑配比下的誘導培養(yǎng)3 7 4 6 苦瓜未受精胚珠在不同激素和添加劑配比下的誘導培養(yǎng)3 9 5討論z 1 3 5 1 苦瓜花粉滅活處理4 3 5 2 葫蘆科近緣屬花粉對苦瓜雌花的影響。4 4 5 3 化學藥劑對苦瓜子房的影響4 7 5 4 滅菌試劑種類和濃度的選擇4 7 5 5 熱激對苦瓜未受精胚珠的影響4 8 5 6 基因型的影響。4 8 5 7 生長激素的影響4 8 5 8 a g n 0 3 對外植體分化的影響4 9 5 9 誘導苦瓜單倍體的潛在途徑4 9 參考文獻5 0 致謝5 6 苦瓜單倍體誘導的初步研究 摘要 苦瓜( m o m o r d i c ac h a r a n t i a l ) 作為一種藥食兼用的保健蔬菜，近年來受到消費 者的青睞。隨著人們對苦瓜需求的增加，對其育種目標提出了多元化的要求。然而， 常規(guī)遺傳育種方法存在育種周期長、難度大等問題，嚴重制約苦瓜的育種進程。而 單倍體育種可以加快優(yōu)良自交系的選育，顯著提高育種速度。 本研究以兩種不同基因型的苦瓜品種z 1 4 1 3 2 3 1 、“翠妃 為實驗材料，分 析了花粉蒙導、化學藥劑處理和未授粉子房離體培養(yǎng)等方法，對苦瓜單倍體誘導的 影響，初步獲得了如下結果： ( 1 ) 用外源花粉對苦瓜子房進行蒙導法處理時，普通絲瓜( 三l 加c y l i n d r i c ar o e m ) 的花粉刺激苦瓜子房生長的效果，要顯著地優(yōu)于黃瓜、冬瓜、南瓜、網(wǎng)紋甜瓜、瓠 瓜等葫蘆科作物。 ( 2 ) 用化學藥劑處理苦瓜花粉時，8 0 1 0 0m g l 的甲苯胺藍溶液能顯著地抑制苦 瓜花粉正常萌發(fā)，導致花粉管異常，有利于刺激苦瓜子房進一步發(fā)育。1 2 二甲 基亞砜溶液能刺激3 0 的苦瓜子房進一步生長，但難以形成商品瓜。 ( 3 ) 比較了不同方法對苦瓜子房外植體的滅菌效果，結果表明用3 次氯酸鈉溶 液滅菌1 0m i n 的效果最好。此外，秋季的滅菌時間應短于春、夏季。 ( 4 ) 取苦瓜雌花開放前1 2 個小時的未受精子房作為外植體，苦瓜子房塊在含有 1 0m g l6 b a ，1 0m g l n a a 的m s 培養(yǎng)基中時，隨著a g n 0 3 濃度上升，能較快 形成愈傷組織，以5m g l a g n 0 3 最高，愈傷率達到9 0 以上。翠妃苦瓜子房對激素 的敏感性大于z 1 - 4 1 3 2 3 1 。 ( 5 ) 取苦瓜雌花開放前1 2 個小時的未受精胚珠作為外植體，接種在1 2 m s 預 培養(yǎng)基上，3 5 黑暗條件下熱激4d ，胚珠明顯膨大生長。將其轉(zhuǎn)接至n a a 濃度 為o 5m g l 、6 b a 濃度為lm g l 、2 ，4 d 濃度為4m g l 的m s 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲 得的愈傷率最高，達到7 1 。c p p u 對苦瓜未授粉子房沒有明顯刺激效應。 關鍵詞：苦瓜( m o m o r d i c ac h a r a n t i al ) ；未受精胚珠：子房；離體培養(yǎng)； 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 a b s t r a c t b i t t e rg o u r d ( m o m o r d i c ac h a r a n t i al ) i sam e d i c a l g o u r dv e g e t a b l e ，a n d w e l c o m e dr e c e n ty e a r s i t sc o n s u m p t i o ni si n c r e a s i n gg r a d u a l l y t h eb r e e d i n go b je c to f b i t t e r g o u r ds h o u l d b ed i v e r s i t y - o r i e n t e d t om e e tt h em a r k e tn e e d h o w e v e r , t h e c o n v e n t i o n a lb r e e d i n gp r o c e s si s l o n gp e r i o da n dg r e a td i f f i c u l t y , l e a dt os e r i o u s l y r e s t r i c t i n gt h eb r e e d i n gp r o g r e s so fb i t t e rg o u r dh y b r i d t h ep r o c e s sw o u l db es h o r t e ra n d e a s i e ro b v i o u s l yt oc h o o s ee x c e l l e n ti n b r e dl i n et h r o u g hh a p l o i db r e e d i n g i nt h i ss t u d y , t w od i f f e r e n tg e n o t y p e so fb i t t e rg o u r dv a r i e t i e sw e r ee x p e r i m e n t a l m a t e r i a l n a m e dz - 1 - 4x13 2 3 - 1a n d “c u i f e i ”a c c o r d i n gt oa n a l y z et h ee f f e c to fp o l l e n m e n t o r , c h e m i c a la g e n ta n di nv i t r ot ou n p o l l i n a t e do v a r y , t h ep r e l i m i n a r i l yr e s e a r c hr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) i np o l l e nm e n t o re x p e r i m e n t ，l u f f a ( l u f f ac y l i n d r i c ar o e m ) p o l l e nw a st h eb e s t f o r e i g np o l l e nt ob es p r e a d e do nt h es t i g m ao fp i s t i l l a t ef l o w e ro fb i t t e rg o u r dt o s t i m u l a t et h eo v a r y sf u r t h e rd e v e l o p m e n tt h a nc u c u m b e r , w a xg o u r d ，p u m p k i n , m e l o n a n db o t t l eg o u r d s ( 2 ) t h ep o l l e ng e r m i n a t i o nw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e db y8 0 10 0m g lt o l u i d i n e b l u es o l u t i o nb e c a u s eo fo b v i o u sa p p e a r a n c eo fa b n o r m a lp o l l e nt u b e ，w h i c hm i g h t s t i m u l a t et h eo v a r yt od e v e l o pf u r t h e r 1 - 2 d m s os o l u t i o nc o u l ds t i m u l a t e3 0 o v a r yt od e v e l o pf u r t h e r ，w h i c hw e r ed i f f i c u l tt of o r mm a r k e t a b l ef r u i t s ( 3 ) c o m p a r i s o nt o d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fn a c l 0s o l u t i o na n dd i f f e r e n t s t e r i l i z a t i o nt i m e t h er e s u l ts h o w e dt h a tu s i n g3 n a c l 0s o l u t i o nt os t e r i l i z e10m i nw a s p r o p e r i na d d i t i o n , t h er e s u l tc l e a r l ys h o w e dt h a tt h es t e r i l i z a t i o nt i m eo fe x p l a n t si n a u t u m nw a sl e s st h a ni ns p r i n go rs u m m e r ( 4 ) t h ee x p l a n tw a so v a r yd o n o mw h i c hw e r ec o l l e c t e d12h o u r sp r i o rt oa n t h e s i s o v a r yb l o c k so fb i t t e rg o u r dw e r ei n d u c e di n t oc a l l u sq u i c k l yi nm sm e d i u mb ya d d i n g 1 0m g l6 b a , 1 0m g ln a aa n d1 0m g l 一6 0m g la g n o s ，a n dt h eh i g h e s tc a l l u s f o r m a t i o nf r e q u e n c yw a sa r o u n d9 0 w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fa g n 0 3w a s5m g l o v a r yb l o c k so f c u i f e i ”w e r em o r es e n s i t i v et oh o r m o n et h a no n e so f z - 1 - 4 x1 3 2 - 3 - 1 ( 5 ) t h eu n p o l l i n a t e do v u l e sw e r ef r o mo v a r yd o n o mw h i c hw e r ec o l l e c t e d12h o u r s p r i o rt oa n t h e s i s t h e yw e r ep e e l e do u to ft h eo v a r yi nt h el a bt ob ei n c u b a t e do n1 2 m s 2 3 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 縮略語表 4 者已經(jīng)在1 6 科3 9 屬7 1 種植物中發(fā)現(xiàn)了單倍體。作物單倍體本身很少有育種價值， 但一旦與常規(guī)育種有機結合，就顯示出了巨大的優(yōu)勢，使作物育種發(fā)生了革命性的 變化。通過遺傳學的理論知識，我們知道單倍體僅僅具有配子的染色體數(shù)，經(jīng)過染 色體加倍后可以迅速獲得純合二倍體，其隱性性狀能夠直接的表現(xiàn)出來而不被顯性 基因掩蓋。因此，通過單倍體獲得純合二倍體的育種手段在作物育種上具有非常重 要的價值，尤其是對于二倍體作物的育種。其重要價值主要表現(xiàn)在以下幾個方面( 周 嫦等，1 9 8 2 ；伍成厚等，2 0 0 4 ) ： ( 1 ) 加速育種進度。首先，單倍體僅僅含有配子的染色體，其間各種隱性性狀 在其染色體加倍后，能夠直接表現(xiàn)出來而不被顯性性狀掩蓋，因此快速提高了育種 的選擇效率；其次，單倍體經(jīng)自然或人工加倍可得到純合二倍體，這一優(yōu)勢對異花 授粉作物和雜交后代來說意義重大，我們知道用傳統(tǒng)的方法獲得較為純合的材料需 要較長時間，而利用單倍體技術可以大大縮短自交純合年限，并快速獲得具有優(yōu)良 穩(wěn)定性狀的自交系，從而減少育種年限，提高育種效率。 ( 2 ) 有助于遠緣雜交類型的培育。因為遠緣雜交時，親本之間存在著較大的遺 傳差異，造成雜種f l 難以結實或結實率很低，并且f 2 及其后世代易出現(xiàn)明顯地性狀 分離。而利用單倍體染色體加倍的方法，就有助于保持新性狀的穩(wěn)定，進而培育出 純合的新類型。 ( 3 ) 物種進化研究。應用單倍體材料可查明其原始親本染色體組的構成，單倍 體植物減數(shù)分裂時，能夠說明有無同源染色體和染色體組參與。假如，在減數(shù)分裂 期發(fā)現(xiàn)大量的i i 價染色體，同時單倍體植株表現(xiàn)出高度可育性，說明核內(nèi)有相同的 染色體組，產(chǎn)生此單倍體植物的相應的二倍體類型起源于多倍體。另外通過對單倍 體孢母細胞減數(shù)分裂時的情況來分析，可以追溯各個染色體組之間是否有同源或部 分同源的關系。這對利用d h 群體進行r a p d 、r f l p 或a f l p 分析物種之間的親緣 關系和物種進化有著重要的意義( g r a n e re ta l ，1 9 9 1 ；m a h e s w a r a ne ta l ，1 9 9 7 ) 。 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 ( 4 ) 構建連鎖圖譜。為構建r f l p 和a f l p 連鎖圖，需要建立合適的作圖群體。 作圖群體大致分為四類：( a ) 基于雜交產(chǎn)生的f 2 群體；( b ) 回交群體( b a c k c r o s s ， b c ) ；( c ) 重組近交系群體( r e c o m b i n a n ti n b r e dl i n e s ，對) ；( d ) 雙單倍體( d o u b l e h a p l o i d ，d h ) 群體。d h 群體的性質(zhì)與砌相似，具有多方面優(yōu)點：d h 群體代表 著一個永久性的群體，因為所有的等位基因都是固定的，可以無限地用于新標記的 作圖，并可在研究小組之間共享；d h 群體可以重復進行檢驗，特別適合于抗性等 數(shù)量性狀的分析；其分子標記基因型可以從自交產(chǎn)生的1 0 2 0 個植株的混合樣品加 以準確的分析。更為主要的是某些作物構建d h 群體比群體更省時。諸如景蕊蓮 等( 1 9 9 9 ) 構建小麥q t l 遺傳圖譜利用花藥培養(yǎng)創(chuàng)建小麥d h 群體。將d h 應用于 分子生物學和基因工程領域，特別是應用于q t l 定位、構建作物分子遺傳圖譜和篩 選植物功能基因等方面時，能極大地方便研究人員的實驗進程。 ( 5 ) 作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體。利用單倍體植株的原生質(zhì)體、細胞和組織作為 外源基因的轉(zhuǎn)化受體，有利于外源基因，尤其是隱性基因的整合和表達。對轉(zhuǎn)基因 單倍體的染色體進行加倍，可以避免轉(zhuǎn)導的外源基因丟失。綜上可見，單倍體育種 技術具有非常重要的理論和實踐意義。 但是在自然界中植物自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低，因而極大地限制了育種工作 者對單倍體的探索和利用。為此植物工作者們一直在努力嘗試各種方法來提高植物 單倍體的誘導頻率，這些方法大致可分成以下兩類： ( 1 ) 植物活體誘導，即人們利用各種物理、化學以及生物的技術手段來刺激植 物活體以誘導單倍體； ( 2 ) 植物離體誘導，活體誘導雖然已經(jīng)取得不少的經(jīng)驗，但至今還不能提供一 種較為通用的方法。隨著實驗胚胎學的興起，使得離體誘導研究逐漸得到植物工作 者的重視和青睞，并日漸成為了主流的實驗方法。植物體外研究可以擺脫整體植株 空間上的制約，注重局部對象的研究，提供較自然且更為穩(wěn)定的實驗條件，能有針 對性地研究條件因素對單倍體發(fā)育的影響，更有效地引進新的實驗技術，能促進外 植體發(fā)育朝著預期的方向進行。 目前，通過人工獲得單倍體的方法有四種：1 、花藥和花粉培養(yǎng)；2 、未受精子 房和胚珠培養(yǎng)；3 、遠緣雜交親本染色體消除法；4 、輻射花粉結合胚搶救。其中， 以花粉和花藥培養(yǎng)的研究最廣泛也最成功。 作為誘導植物單倍體的一條途徑，未受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)與花粉和花藥 的離體培養(yǎng)具有同樣重要的價值和意義。但是由于技術上的原因，未受精子房和胚 6 苦瓜單倍體誘導的初步研究 珠離體培養(yǎng)的研究和利用程度不及花粉和花藥培養(yǎng)。即便如此，前人的實驗證明未 受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)誘導單倍體途徑具有其不可替代的優(yōu)勢( 周嫦等1 9 8 2 ； 王文和，2 0 0 5 ) ： ( 1 ) 至今，有較多作物的花藥和花粉培養(yǎng)很難成功或者其誘導單倍體頻率太低， 未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)可能提供另一條有效的單倍體誘導途徑，如葫蘆科、百 合科等作物； ( 2 ) 雄性不育植物的單倍體培養(yǎng)； ( 3 ) 對于禾本科植物，用花藥和花粉培養(yǎng)誘導出的單倍體的白化苗率通常很高， 未受精子房和胚珠誘導則可獲得較多綠色苗； ( 4 ) 在某些植物中花粉和花藥植株表現(xiàn)出明顯的倍性和性狀變異，未受精子房 和胚珠離體培養(yǎng)可能提供一條獲得較為穩(wěn)定后代的途徑。 此外，未受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)可以為研究胚囊單倍體細胞自發(fā)成胚的發(fā) 育機理建立一個良好的離體體系。 1 2 國內(nèi)外研究進展 離體培養(yǎng)未受精子房和胚珠是為了誘導植物雌核離體發(fā)育，而植物雌核離體發(fā) 育的目的就是產(chǎn)生單倍體( h a p l o i d ) 、自然加倍或人工加倍的雙單倍體以及多倍體 與非整倍體植株，我們把這三類植株統(tǒng)稱為胚囊植株，胚囊植株在植物遺傳學以及 作物育種實踐中具有很高的研究和利用價值。 早在二十世紀五十年代植物學家和育種家就開始了對未受精子房和胚珠離體培 養(yǎng)的探索，嘗試著以此找到一條獲得單倍體的新途徑，然而沒有成功( 周嫦等，1 9 8 2 ) 。 二十世紀六十年代，t u l e c k e ( 19 6 4 ) 通過銀杏( g i n k g ob i l o b a ) 未受精雌配子的離 體培養(yǎng)，獲得了單倍體的愈傷組織，但是沒有分化出植株。n i s h i 和m i t s u o k a ( 1 9 6 9 ) 在對水稻( o r y z as a t i v a ) 未受精子房的離體培養(yǎng)中獲得了二倍體和四倍體植株，但 是沒有獲得單倍體植株。u c h i m i y a 等( 1 9 7 1 ) 通過對玉米( z e am a y s ) 未受精子房 和茄子( s o l a n u mm e l o n g e n a ) 未受精胚珠的離體培養(yǎng)誘導出了愈傷組織，而且觀察 到愈傷組織中有單倍體細胞的分裂，從而證明了通過未受精雌配子體的離體培養(yǎng)誘 導單倍體植株是可行的。s a nn o e u r n ( 1 9 7 6 ) 利用大麥( h o r d e u mv u l g a t e ) 未受精 子房首次誘導出單倍體植株，并開創(chuàng)性的提出了“離體雌核發(fā)育”( i nv i t r o g y n o g e n e s i s ) 的概念。此后，國內(nèi)的植株科學工作者利用煙草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 7 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 和小麥( t r i t i c u ms a t i v u m ) 的未受精子房誘導出了單倍體植株( 祝仲純等，1 9 7 9 ) ， 以后相關的報道逐漸增多。 從所查的文獻報道來看，國內(nèi)相關的研究工作主要集中在二十世紀八十年代， 涉及的作物主要有水稻、小麥、大麥、玉米、向日葵、煙草、非洲菊、百合、韭菜 等作物，而且獲得了這些作物的單倍體及雙單倍體胚囊植株。這些研究所涉及的內(nèi) 容主要包括未受精胚珠和子房離體培養(yǎng)以及再生體系的建立，各種因素對誘導頻率 的影響能力，再生植株的倍性鑒定方法及其發(fā)育起源的研究等，并對國內(nèi)外的相關 研究進展做出了綜述報道( 周嫦等，1 9 8 2 ) 。這些研究工作有力的推動了國內(nèi)的單倍 體研究發(fā)展，其中很多的研究結果還為國外的相關研究提供了重要的參考。進入二 十世紀九十年代以后，相關的報道卻逐漸減少。近幾年來，人們對于農(nóng)作物新品種 的需求在日趨增長，豐富種質(zhì)資源、選育符合各種消費環(huán)境的農(nóng)作物新品種成為了 當務之急。隨著科學技術的發(fā)展，作物育種技術水平也得到了飛速發(fā)展，尤其是分 子標記技術在遺傳育種研究中的廣泛應用，使得單倍體誘導研究在國內(nèi)再一次興起。 其中，在黃瓜未受精子房的離體培養(yǎng)研究上取得了重大突破( 杜勝利，2 0 0 1 ) ，并已 將研究成果成功地應用到黃瓜的新品種選育上。 在這方面的研究上，國外學者的研究與國內(nèi)情況相異，從二十世紀九十年代到 二十一世紀初的一些文獻報道中可以看出，國外的研究主要集中在探索并完善未受 精子房和胚珠離體培養(yǎng)單倍體途徑上，而且很多研究工作已經(jīng)進入到尋找再生胚囊 植株農(nóng)藝性狀遺傳規(guī)律的階段，其中有些研究成果轉(zhuǎn)化到了育種實踐中。表( 1 ) 是 未受精子房或胚珠培養(yǎng)已獲單倍體的物種。 8 苦瓜單倍體誘導的初步研究 表i 未受精子房或胚珠培養(yǎng)已獲單倍體植株的物種 t a b l e1t h es p e c i e so fh a p l o i dp k n bo b t a i n e db yc u l t u r e du n p o l l i n a t e do v a r i e so ro v u l e s 從文獻報道中可以發(fā)現(xiàn)研究多集中在禾本科、百合科、葫蘆科、茄科以及菊科， 其中以禾本科的研究最多。在水稻( 周嫦等，1 9 8 3 ；l i ，1 9 9 8 ) 和非洲菊( g e r b e r a j a m e s o n i i ) ( m e y n e te ta 1 ，1 9 8 4 ) 的未受精子房和胚珠的離體誘導單倍體中已分別建 立起可重復的培養(yǎng)流程。而且l i ( 1 9 9 9 ) 對水稻未受精子房獲得的單倍體植株的某 9 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 些農(nóng)藝性狀進行了遺傳學分析。b o h a n e c ( 2 0 0 1 ) 對洋蔥未受精子房培養(yǎng)發(fā)育來的株 系進行了r a p d 分析，證明了再生植株的基因型是穩(wěn)定的，s e r i k ( 1 9 9 7 ) 報道了未 受精子房和胚珠誘導獲得的單倍體植株已經(jīng)應用在水稻、甜菜、洋蔥和非洲菊的育 種上。對于甜瓜的未受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)，最早是f i c e a d e n t i ( 1 9 9 9 ) 獲得成 功，得到了單倍體，其次是l o t i f i 等( 2 0 0 3 ) 采用f i c c a d e n t i 的誘導方法獲得了三棵 幼苗，但是還未來得及鑒定就死亡了，最后是韓麗華等( 2 0 0 4 ) 獲得了6 棵胚囊植 株，而且鑒定有單倍體植株。未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的研究開辟了另一條單倍 體育種途徑，這為作物育種開創(chuàng)了新的研究領域，并且隨著實驗生殖細胞學的興起， 也為研究雌核發(fā)育和開展植物遺傳工程提供了良好的平臺。 縱觀國內(nèi)外的相關研究報道，未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的研究主要集中在以 下幾個方面：( 1 ) 建立可重復的離體培養(yǎng)體系；( 2 ) 探索人工誘導單倍體的影響因 素；( 3 ) 再生胚囊植株的倍性鑒定：( 4 ) 研究再生胚囊植株的發(fā)育起源；( 5 ) 單倍 體胚囊植株的人工加倍方法；( 6 ) d h 群體的農(nóng)藝性狀分析以及和親本的性狀比較。 離體雌核誘導單倍體的育種途徑應用的關鍵技術就是能否有效的提高再生胚囊 植株的誘導頻率，因此，深入研究植物離體雌核發(fā)育機理非常重要。但是，目前這 方面的文獻很少，報道的也只是植物工作者的一些推測，還得不到證實。因為，影 響離體雌核發(fā)育的因素太多，而且難以控制胚囊發(fā)育的同步性，所以很難調(diào)控雌核 的發(fā)育動向，同時很難控制雌核朝著指定的方向發(fā)育。反過來，未受精子房和胚珠 培養(yǎng)可以提供一個半離體的手段對胚囊的發(fā)育進行遠比過去深入細致的研究( 周嫦， 1 9 8 2 ) 。為了更好的將相關的研究成果應用到遺傳學和育種的研究實踐中，植物工作 者應進一步開展基礎性研究，深入組織、器官、細胞以及分子水平對植物離體雌核 發(fā)育的機理進行研究。 綜合未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)研究的文獻資料后，我們發(fā)現(xiàn)，影響未受精子 房和胚珠培養(yǎng)的因素有很多，包括供體植株的基因型、未受精子房和胚珠的發(fā)育時 期即胚囊細胞的發(fā)育時期、基本培養(yǎng)基類型、供體植株的栽培季節(jié)、外植體培養(yǎng)前 的預處理、外植體的接種方式、培養(yǎng)方式、以及培養(yǎng)條件等，其中培養(yǎng)條件又包括 激素組成、p h 值、外源添加物等。但是，這些影響因素并不是獨立存在的，往往實 驗結果受到多個實驗因素的影響。下面就關于各種影響未受精子房和胚珠離體誘導 單倍體的因素作進一步研究。 1 0 苦瓜單倍體誘導的初步研究 1 2 1 供體植株的基因型 和其他的組織培養(yǎng)一樣，在未受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)中，誘導成功與否以 及誘導頻率高低均受到基因型的明顯影響，在水稻的未受精子房和胚珠培養(yǎng)中，周 嫦等( 1 9 8 3 ) 發(fā)現(xiàn)粳稻胚囊愈傷組織的誘導頻率最高，其次是秈稻。l i 等( 1 9 9 9 ) 在對1 1 個水稻品種進行未受精子房培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)基因型導致愈傷組織的誘導頻率在 0 8 到1 2 5 之間變動。在對非洲菊( g e r b e r a j a m e s o n i i ) ( m i y o s h i ，1 9 9 6 ) 的1 7 個 基因型未受精子房培養(yǎng)中，有4 個基因型沒有產(chǎn)生愈傷組織。g e m e s j u h a s z 等( 2 0 0 2 ) 在對5 個黃瓜品種進行未受精子房培養(yǎng)得到的單倍體植株誘導頻率最高的為1 8 4 ， 最低的為7 1 。謝冰等( 2 0 0 5 ) 發(fā)現(xiàn)基因型對西葫蘆胚狀體的誘導有很大的影響， 在對小油菊( g u i z o t i aa b y s s i n i c al ) 未受精子房離體培養(yǎng)中，b h a t ( 2 0 0 7 ) 發(fā)現(xiàn)胚 狀體的誘導頻率從2 5 到1 2 5 不等。t a r e k ( 2 0 0 7 ) 在對1 2 個西葫蘆品種的未受 精胚珠離體培養(yǎng)時也發(fā)現(xiàn)了基因型是一個關鍵的因素，子房的反應率從o 到4 8 8 不等。而在甜菜( m a r y l i s e 。1 9 8 9 ) 的未受精子房離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)基因型只有在特定 的培養(yǎng)基條件下才產(chǎn)生明顯的影響。另外，在草莓( 王文和，2 0 0 1 ) ，向日葵( 閻華 等，1 9 8 8 ) 等作物上也發(fā)現(xiàn)了基因型的影響。以上的文獻報道表明，基因型對未受 精子房和胚珠離體培養(yǎng)單倍體具有很大的影響。因此，我們在探索培養(yǎng)條件時應根 據(jù)不同的基因型做出相應的調(diào)整，并深入到細胞和分子水平探索基因型影響的機理。 1 2 2 接種時未受精子房和胚珠的發(fā)育時期( 胚囊成熟度) g e m e s j u h a s z 等( 2 0 0 2 ) 在研究黃瓜未受精子房離體培養(yǎng)時選取開花前3 天， 開花前6 個小時，以及開花當天的子房為實驗材料，結果表明：只有開花前6 個小 時的胚珠經(jīng)過6 1 2 周的培養(yǎng)能得到胚狀體，其他的時期的子房則不能誘導出胚狀體。 韓麗華等( 2 0 0 4 ) 在甜瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)中依據(jù)前人的研究成果，采取的樣品 是開花前1 4h 的子房，并誘導成功獲得了單倍體植株和其他胚囊植株，此時胚囊處 于接近成熟胚囊的狀態(tài)。而謝冰等( 2 0 0 5 ) 在對西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)研究中 發(fā)現(xiàn)，接種時胚珠的發(fā)育時期是西葫蘆離體雌核發(fā)育的關鍵因素，其作用大于培養(yǎng) 基與供體基因型的效應，其結果表明：開花當日的胚珠平均誘導率最高為1 5 1 ， 其次是開花前一日的胚珠為1 3 2 ，誘導率最低的是開花后一日的胚珠為0 9 。開 花當日的胚囊為成熟胚囊，開花前一日的胚囊為接近成熟的胚囊。b h a t ( 2 0 0 7 ) 在 小油菊的研究上也得出了類似的結論：在開花當天和開花前一天采的子房能出胚， 而開花前兩三天的花不能出胚。從以上文獻中可以看出，對于葫蘆科的作物，成熟 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 胚囊或接近成熟的胚囊比較容易誘導成功或者誘導的頻率較高。因此，選擇合適的 胚囊成熟度對實驗的成功與否起著重要的作用。 1 2 3 培養(yǎng)基對未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的影響 在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基為外植體的生長發(fā)育提供了所需的營養(yǎng)物資，所以 培養(yǎng)基對外植體的培養(yǎng)起著至關重要的作用。而培養(yǎng)基的影響除了其自身的形態(tài)外， 還包括其所含的其他成分：基本培養(yǎng)基組成、添加的各種外源激素的種類和濃度、 碳源種類和濃度、p h 值、瓊脂以及其他的有機無機成分( 表2 ) 。任何一個因素的 改變都可能會對實驗結果造成很大的影響，但是這些因素又是一個整體，對外植體 生長發(fā)育的影響是綜合的效應。而每一種實驗材料都有其最適合的培養(yǎng)基，很難找 到一種較為通用的培養(yǎng)基，因此在具體的實驗過程中，我們需要針對不同的培養(yǎng)材 料，篩選出各自適合的培養(yǎng)基，這需要大量的工作。 表2 未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基 t a b l e2t h em e d i u mo fi nv i t r oc u l t u r eu n p o l l i n a t e do v a r i e sa n do v u l e s 種名萎1 7添加物參考文獻 s p e c i e s ! 壁 a d d i t i o n a l c o m p o n 朗t s r e f c r e n c e b a s a im e d i u m 。 g “拓d f 蛔a b y s s i n i c a ( l f ) c a s s m s 2 o i u n 2 ，4 - d + i 0 1 a m k t + 3 0 9 l 蔗糖 b h a te ta 1 ，2 0 0 7 e r a g r o s t i st e fm s ，l 3 9 2 m 2 ，4 一d + 8 9 岬【l b a pg u g s ae la 1 ，2 0 0 6 a r a b i d o p s i st h a l i a n a m s 2 嘰b a p m 1 m g l n a a + 6 0 9 l 蔗 r o j e ke ta 1 ，2 0 0 5 a l l i u mc e p a b 5 2 蔗0 糖m g l 2 4 - 蚴呲6 b a + 7 5 e n d a n ge ta l 測 b e t av u l g a r i s m s 1 0 - 2 0 m g l b a p + 10 蔗糖 g u r e lc ta 1 ，2 0 0 0 1 0 - 2 o m g l 2 ，4 - d + i o m g l n a a + o t r i t i c u md u r u md e s f 改良m s 5 - 1 0 m g l k t + 0 1 m g l i p a + 3 0 9 l o l f ae le l ! ，2 0 0 7 蔗糖+ 6 0 9 l 麥芽糖 h y o s c y a m u sm u t i c u sm s ，b n0 0 5 m g l n a a + o 5 m g l 6 - b a c h a n dc ta 1 ，19 9 8 p s o r a l e 口c o r y l i f o l i a m s 磊囂籌蚴+ 3 m 丘蝴c h a n d 齜a l2 0 0 s o , y z aj 口f v a n 6 0 2 5 m g l n a a + 0 5 m g l i 從+ 2 舳 l ie ta l ， g ，l k t 1 9 9 8 c u c u m i ss a t i v u $c b m ：勰囂裟刪2 耋裂n h o r d e u mv u l g a r e n 6 譽囂器囂8 岬4 4 岫c “刪9 9 c u c u r b i t a p e p o m s 1 0 r s m g l 2 ，4 - d + 3 0 9 l 蔗糖m e l w a l l ye la 1 ，1 9 9 8 c u c u r b i t a p e p o n 6 2 4 d 卜n a a + b a + 3 蔗糖謝冰，2 0 0 6 c u c u m i sm e i o c b m韓麗華，2 0 0 4 h e v e ab r a s i l i e n s i sm u e i l - a r g 改良m b l i n g l 2 4 _ d + 1 2 m g l k t 楊曉泉，1 9 9 7 蘭些絲竺竺絲：竺竺堅!生：巴巴型塵：蘭巴絲堅蘭壘里墨堡：1 2 1 2 1 2 苦瓜單倍體誘導的初步研究 1 2 3 1 基本培養(yǎng)基對未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的影響 對于未受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)，常用的基本培養(yǎng)基有m s 、n 6 、b 5 、c b m 等，或以這些培養(yǎng)基為基礎的改良培養(yǎng)基，其中又以m s 培養(yǎng)基應用得最為廣泛。 1 2 3 2 外源激素對未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的影響 從表2 中可以看出，每個成功的未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)試驗都添加了外源 激素，外源激素的種類和濃度均對未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)起著至關重要的作用， 所用的外源激素種類有：m a 、n a a 、6 - b a 、k t 、g a 3 、t d z 、b a p 、m c p a 等， 在水稻的未受精子房的研究中，周嫦等( 1 9 8 1 ) 發(fā)現(xiàn)，外源激素的濃度對促進雌核 發(fā)育、防止體細胞增生起著關鍵的作用，不加外源激素的培養(yǎng)基很難啟動雌核發(fā)育， 而且增加外源激素的濃度有利于未受精子房的生長，但較低的激素濃度更利于雌核 發(fā)育，過高的外源激素容易導致體細胞的愈傷化。王文和( 2 0 0 1 ) 在對草莓的未受 精子房的離體培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，2 ，4 d 是成功誘導所必需的外源激素，當2 ，4 d 濃度小于2 0m g l 時，誘導效果隨2 ，4 d 濃度增大而增大，2 ，4 d 濃度為2m g l 時誘導頻率最高。而添加k t 和b a 等細胞分裂素類物質(zhì)則對雌核的發(fā)育有抑制作 用并促進體細胞愈傷組織的增生，對誘導不利。在很多作物中，t d z 是一種應用很 廣泛的外源激素，尤其是在葫蘆科作物的未受精子房和胚珠的離體培養(yǎng)中，如黃瓜 ( g e m e s j u h a s ze ta 1 ，2 0 0 2 ；d i a oe ta 1 ，2 0 0 9 ) 、甜瓜( 韓麗華等，2 0 0 4 ) 。眾多的文 獻資料說明，植物的雌核發(fā)育需要外源激素的刺激，但是外源激素的種類和濃度又 依據(jù)外植體的種類的不同而不同，而且不同的外源激素種類和濃度對刺激雌核發(fā)育 和體細胞增生兩方面都有影響。 1 2 3 3 碳源的濃度和種類對未受精子房和胚珠離體的影響 從表( 2 ) 可以發(fā)現(xiàn)蔗糖是未受精子房和胚珠離體培養(yǎng)的常用碳源，使用濃度因 作物的種類而異，蔗糖濃度從3 到1 0 不等。t a r e ke ta 1 ( 2 0 0 7 ) 在西葫蘆未受精 胚珠的離體培養(yǎng)中比較了3 0 、6 0 、9 0g l 三個蔗糖濃度的效應，發(fā)現(xiàn)3 0g l 的蔗糖 濃度是最佳濃度，而9 0g l 的蔗糖濃度沒有誘導出胚囊植株。除作為碳源外，蔗糖 還通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓來影響胚狀體的誘導。對于其他的碳源，麥芽糖也可 以作為一種碳源應用在試驗中，而且其效果優(yōu)于蔗糖。o l f ae ta 1 ( 2 0 0 7 ) 在t r i t i c u m d u r u md e s f 未受精子房的研究中發(fā)現(xiàn)，麥芽糖能提高反應的子房發(fā)生率。sc h a n de t a 1 ( 2 0 0 7 ) 在對p s o r a l e ac o r y l i f o l i a 未受精子房的培養(yǎng)研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象， 華中農(nóng)業(yè)大學2 0 1 0 碩士研究生學位論文 在比較3 0 、4 o 、5 0 、6 o 的蔗糖和麥芽糖濃度的影響時發(fā)現(xiàn)：胚狀體誘導率 在各種濃度的麥芽糖培養(yǎng)下均高于蔗糖，其中麥芽糖濃度為5 o 時胚狀體的誘導率 最高，可能原因是麥芽糖可以直接被外植體吸收利用，而蔗糖需要水解成單糖才能 被吸收利用。因此，在選擇碳源時，不僅要考慮碳源的濃度，也要考慮到碳源的種 類。 1 2 4 培養(yǎng)條件對未受精子房和胚珠的影響 1 2 4 1 接種方式的影響 從所查的文獻報道中可以發(fā)現(xiàn)，大部分的未受精子房和胚珠都是在固體培養(yǎng)基 中進行的。在固體培養(yǎng)基上，外