摘要 本研究通過(guò)對(duì)不同大熊貓圈養(yǎng)單位的人工乳配方，以及黑熊，成都麻羊等動(dòng)物 初乳的初步分析，選定了大熊貓代用乳配方；檢測(cè)了由大熊貓母親育幼的大熊貓初 生幼仔腸道菌群的建立及組成情況；應(yīng)用生化的方法測(cè)定了大熊貓幼仔血清中y 一 球蛋白含量：將收集到的健康成年大熊貓血清凍干，并進(jìn)行了凍干血清微生物培養(yǎng)、 動(dòng)物口服等安全試驗(yàn)。為提高大熊貓初生幼仔免疫力的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。 研究結(jié)果： 1 、通過(guò)對(duì)圣迭哥動(dòng)物園、北京動(dòng)物園以及成都大熊貓繁育研究基地的人工乳的配方， 以及黑熊成都麻羊和大熊貓初乳中粗蛋白、粗脂肪、乳糖、礦物質(zhì)元素的含量進(jìn)行 分析，通過(guò)比較檢測(cè)結(jié)果，認(rèn)為成都大熊貓繁育研究基地的人工乳配方比較適合大 熊貓幼仔。此配方為：山羊初乳：熊貓奶粉( p a n d am i l k ) ：去離子水= 3 ：l ：6 ( 質(zhì)量 比) 2 、大熊貓幼仔腸道f 常菌群與其它動(dòng)物相比比較特殊，厭氧菌的檢出率和含量相對(duì) 較低。l 一3 j 同齡大熊貓幼仔腸道正常菌群中以大腸埃希氏菌、糞鏈球菌為主。這期 間糞便中菌群組成為較單純，基本沒(méi)有什么變化，在2 5 同齡時(shí)才檢測(cè)到乳桿菌，但 僅是微量。截止2 月齡沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌，腸道菌群也基本沒(méi)有變化。 3 、雙縮脲法測(cè)定大熊貓初生幼仔血清中總蛋白量，電泳分析不同蛋白比例，發(fā)現(xiàn)y 一球蛋白含量極低，截止1 9 周齡最高僅為1 9 9 1 ，為成年大熊貓的2 2 6 2 ，y 一球 蛋白僅占血清總蛋白4 1 ，而成年大熊貓此數(shù)據(jù)為1 2 0 9 ：1 3r 齡死亡的一只幼 仔y 一球蛋白含量?jī)H為0 4 9 1 ，為成年大熊貓的4 7 6 ，y 一球蛋白占血清總蛋白 1 5 ，證明大熊貓初生幼仔免疫力低下。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定了計(jì)算大熊貓幼仔添加 成年大熊貓血清量的公式：添加劑量：7 5 m l l o o g 體重幼仔體重5 0 x6 m g m l - 7 - 5 0 8 ，4 m g m l 4 、健康成年大熊貓的血清凍干處理后進(jìn)行微生物培養(yǎng)、哺- l 4 , 鼠口服等安全試驗(yàn)， 證明口服凍干后的血清不會(huì)造成試驗(yàn)動(dòng)物腹瀉或發(fā)育不良等負(fù)面影響。 關(guān)鍵詞：大熊貓初生幼仔人工乳腸道正常菌群凍干血清免疫添加劑 前言 營(yíng)養(yǎng)與免疫是營(yíng)養(yǎng)學(xué)與免疫學(xué)相結(jié)合的一門(mén)新興學(xué)科。營(yíng)養(yǎng)素具有免疫功能是 本世紀(jì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)極富成就的發(fā)現(xiàn)之一。在此方向上人們投入的研究力 量不斷加強(qiáng)，隨著研究的深入，人們對(duì)能量與免疫、脂類(lèi)與免疫、礦物質(zhì)微量元素 與免疫、維生素與免疫等問(wèn)題都有了較為深刻的認(rèn)識(shí)，并應(yīng)用于我們的生活中，對(duì) 提高人類(lèi)生活質(zhì)量起了重要作用。同時(shí)應(yīng)用于家畜的飼養(yǎng)實(shí)踐中，對(duì)防治應(yīng)激、預(yù) 防疾病、提高畜禽生產(chǎn)力方面也起到了重要作用。營(yíng)養(yǎng)、免疫和感染三者的互作關(guān) 系是動(dòng)物機(jī)體健康和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的核心。主動(dòng)免疫需要大量的能量和蛋白質(zhì)參與免疫 活性細(xì)胞的分裂分化和效應(yīng)性分子免疫球蛋白的合成( d r e w ，1 9 9 9 ) 。因此，動(dòng)物機(jī) 體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)啟動(dòng)強(qiáng)而有效的免疫應(yīng)答至關(guān)重要?？v使輕微的某單一營(yíng)養(yǎng)成分的 缺乏也會(huì)嚴(yán)重?fù)p害免疫功能。免疫反應(yīng)也影響到動(dòng)物機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)需要，除合成淋巴 細(xì)胞時(shí)蛋白質(zhì)需要增加養(yǎng)分外，免疫介質(zhì)的釋放也會(huì)顯著改變基礎(chǔ)代謝。因此，營(yíng) 養(yǎng)和免疫是密切關(guān)聯(lián)的互作系統(tǒng)，應(yīng)把二者作為整體，而不是作為互不相干的獨(dú)立 因素來(lái)研究。 母乳為哺乳動(dòng)物新生幼仔提供營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源，能為幼仔的生長(zhǎng)發(fā)育提供全面、 均衡的營(yíng)養(yǎng)，能促進(jìn)機(jī)體功能的成熟。不僅如此，其所含的免疫物質(zhì)、激素、生長(zhǎng) 因子、細(xì)胞因子等能將母親與初生幼仔在生物化學(xué)、免疫功能之問(wèn)的聯(lián)系建立起柬， 還能影響胃腸道發(fā)育，對(duì)預(yù)防初生幼仔疾病、過(guò)敏反應(yīng)等起保護(hù)作用，為任何代乳 品所不及，所以母乳是動(dòng)物初生幼仔包括人嬰兒的最佳天然食物。母乳與新生兒免 疫是一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域。用功能性免疫球蛋白和其它免疫刺激物質(zhì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成 分平衡的人工乳進(jìn)行強(qiáng)化，并將這種方法作為新生仔畜的免疫性保護(hù)手段，這對(duì)提 高動(dòng)物健康和改善生產(chǎn)性能是- - h p 常有前途的方法。 1 初乳的生物學(xué)意義 初乳通常呈黃色，粘度較大，略偏酸性。泌乳開(kāi)始后如何劃定初乳的時(shí)間范圍， 還很不統(tǒng)一，乳業(yè)生產(chǎn)中習(xí)慣把第一周的牛奶稱(chēng)為初乳，但現(xiàn)在明顯地傾向于根據(jù) 乳中各組分組成的濃度和活性來(lái)區(qū)分初乳和常乳。 新生的哺乳幼仔，胃腸道未發(fā)育完全，消化、吸收機(jī)能不健全，體內(nèi)只有非常 有限的糖、脂、維生素和微量元素的貯備，通常缺乏母源抗體和應(yīng)變能力，難以抵 抗環(huán)境因子( 物理的、化學(xué)的和生物學(xué)的) 的作用。而此時(shí)的初乳，包含有保證其生 2 存和生長(zhǎng)所需的所有物質(zhì)，因此具有獨(dú)特的生物學(xué)意義。 概括的說(shuō)，乳和初乳對(duì)于新生哺乳幼仔有三方面的功能：提供能量和生物合 成前體物的營(yíng)養(yǎng)性功能；提供特異的和非特異的免疫保護(hù)的防御機(jī)能；傳達(dá)母 源神經(jīng)與內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)信號(hào)功能。因此把乳僅看作是新生哺乳幼仔單純的營(yíng)養(yǎng)源的 觀點(diǎn)已顯陳舊，特別是初乳在哺乳幼仔生長(zhǎng)發(fā)育早期，在為幼仔提供免疫保護(hù)和傳 達(dá)代謝信息方面有特殊的貢獻(xiàn)?；谶@樣的認(rèn)識(shí)，對(duì)初乳的生化性質(zhì)研究以及深度 刀+ 發(fā)成了當(dāng)前的熱點(diǎn)。 2 初乳的成分及作用 2 1 初乳的成分 初乳和常乳的劃分是根據(jù)乳中各組分的濃度和活性。初乳一般指母畜分娩后 3 5 d 所分泌的乳汁，它的化學(xué)成分和物理性質(zhì)都與常乳有很大區(qū)別。母乳作為初生 幼仔唯一的營(yíng)養(yǎng)源要為幼仔的發(fā)育提供能量、蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)元 素等。因?yàn)槌跎鬃械南驼{(diào)節(jié)系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，并且受出生后新環(huán)境應(yīng)激的 影響，所以初乳含有比常乳高得多的養(yǎng)分，如豐富的維生素和球蛋白等，特別是含 有一些初生動(dòng)物健康生長(zhǎng)所必需的生長(zhǎng)因子( 見(jiàn)表1 ) ，這些成分對(duì)初生動(dòng)物接受被動(dòng) 免疫、被動(dòng)提高抗病力、促進(jìn)胃腸道的迅速生長(zhǎng)有關(guān)鍵作用。初乳的蛋自質(zhì)、脂肪、 灰分和密度均高于常乳，隨著泌乳期的延長(zhǎng)而下降，初乳成分逐漸接近常乳水平( 見(jiàn) 表2 ) ；p h 和乳糖的變化規(guī)律與之正相反。牛初乳中c a 、n a 、m g 、c l 、f e 、z n 、c u 的 含量均高于常乳幾倍，甚至幾十倍，但是k 和p 的含量較常乳低。 2 2 初乳的作用 2 2 1 初乳的營(yíng)養(yǎng)作用 新生幼仔生長(zhǎng)初期，初乳不僅為其提供營(yíng)養(yǎng)，由于其含有較高濃度的生物活性 物質(zhì)，也成為刺激器官快速生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)之一。b u r r i n ( 1 9 9 5 ) 等的研究表明， 喂初乳可增強(qiáng)仔豬消化能力。喂初乳的犢牛血清總蛋白質(zhì)含量和白蛋白的含量均較 高( d a n i e k ，1 9 9 4 ) 。初乳中的生長(zhǎng)因子和激素能調(diào)節(jié)新生幼仔胃腸道發(fā)育，也能調(diào)節(jié) 消化道的消化和吸收功能。b u h h e r 等( 1 9 9 8 ) 的研究表明，初乳使牛小腸絨毛變長(zhǎng)，延 長(zhǎng)喂初乳的時(shí)間，改變了小腸的形態(tài)，提高了小腸的吸收力。 2 2 2 初乳的免疫作用 關(guān)于哺乳動(dòng)物的大量研究證明，初生幼仔可以通過(guò)吃初乳獲得被動(dòng)的免疫力。 初乳中被確認(rèn)的免疫物質(zhì)越來(lái)越多，如免疫球蛋白、免疫活性細(xì)胞及非抗體保護(hù)蛋 白等。乳汁中的免疫物質(zhì)對(duì)幼仔具有兩種完全不同的保護(hù)作用。種是初乳吸收進(jìn) 入幼仔循環(huán)系統(tǒng)后，提供被動(dòng)的可以預(yù)防微生物侵入的循環(huán)抗體。第二種是不被吸 收的乳汁，在消化道內(nèi)提供一種被動(dòng)的能保護(hù)腸管疾病的局部免疫力，其中l(wèi) g g 、i g a 和i g m 都具有保護(hù)哺乳動(dòng)物小腸的作用( 李蜀眉1 9 9 9 ) 。初乳中的免疫球蛋白能夠有 效地被新生幼仔吸收與初乳本身的特點(diǎn)及新生幼仔小腸細(xì)胞的發(fā)育程度有關(guān)。關(guān)于 這個(gè)問(wèn)題，有些人提出過(guò)一些見(jiàn)解( n k r e t e c h m e r ，1 9 8 4 ) ： ( 1 ) 初乳中含有豐富的胰蛋白酶抑制劑，有間接阻止各種蛋白酶水解免疫球蛋白的作 用( t a p p r ，1 9 7 9 ；s a i k k u ，1 9 7 9 ) ； ( 2 ) 免疫球蛋白是糖蛋白，糖可做為外殼對(duì)免疫球蛋白起保護(hù)作用： ( 3 ) 初乳的緩沖量大，具有減少免疫球蛋白在胃中變性的傾向； ( 4 ) 免疫球蛋白的氨基酸排列順序很特殊，沒(méi)有胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶所起 作用的肽鍵。 表1 初乳中某些生k 岡子的含目j j _ ( n g m 1 ) t a b l e it h ea m o u n to f s o m e g r o w t hf a c t o r si nt h ec o i o s t r u m sa n dm i l k s 表2 牛初乳部分成分與常乳的比較( 初乳成分為常乳成分的百分?jǐn)?shù)) t a b l e2t h e c o m p a r i s o no f c o m p o s i t i o n o f c o l o s t r u m sa n dm i l k 2 3 初乳中免疫球蛋白的功能及來(lái)源 初乳和常乳中免疫球蛋白的含量不同( 見(jiàn)表3 ) ，乳中的免疫球蛋白包括i g g 、i g a 和i g m 等。人和兔初乳中主要的免疫球蛋白為i g a ，占初乳中免疫球蛋白總量的8 9 8 ， 也含有較高濃度的i g m 。其中i g a 對(duì)酸堿和蛋白酶的水解作用有較強(qiáng)的抵抗力，因此 能在消化道中保持其抗體活性，當(dāng)其進(jìn)入消化道后可附著在消化道粘膜表面，以防 止病原體吸附到腸壁上，達(dá)到了排菌的作用( w e l k e rw a ，1 9 7 6 ；w e l k s hj k ，1 9 7 9 ) 。 牛、豬初乳中免疫球蛋白主要為i g g 。約占免疫球蛋白總量的8 0 ，這與牛、豬胎盤(pán) 的特殊結(jié)構(gòu)使母體血液中免疫球蛋白不能直接進(jìn)入胎兒有關(guān)。豬初乳中i g g 具有保護(hù) 乳腺和向幼仔提供被動(dòng)免疫力的雙重作用。這些免疫球蛋白直接來(lái)源于母體血液循 環(huán)，因此，它們屬于那些專(zhuān)一對(duì)付母體曾遭遇的病原體的免疫球蛋白。假如新生幼 仔所處生活環(huán)境與母體相同，那么這些免疫球蛋白就能為幼仔提供所需要的專(zhuān)一性 免疫保護(hù)。而且出于i g g 的半衰期較長(zhǎng)( 1 4 天) ( b o u r n e 年dc a r t i s ，1 9 7 3 ) ，因此，仔 畜體內(nèi)來(lái)源于母體的l g g 的濃度可以在幾周內(nèi)維持較高的濃度( k u m a r ，1 9 9 8 ) 。 豬的常乳中i g a 含量較高，而初乳中i g g 的含量占主導(dǎo)地位。初乳與常乳中免疫 球蛋白的生理來(lái)源截然不同。母豬初乳中絕大部分i g g 和4 0 的l g a 直接由母豬血液 中轉(zhuǎn)移而來(lái)( f r a n c k 等，1 9 7 5 ) 。母豬乳腺上皮細(xì)胞的特殊受體負(fù)責(zé)將i g g d q 血液轉(zhuǎn)入 初乳( b r a n d o n 等，1 9 7 1 ) 。豬分娩后2 4 4 8 小時(shí)后由血液轉(zhuǎn)入乳中的免疫球蛋白急劇 下降，在產(chǎn)后第3 天，乳中9 0 的i g a f l t o 的i g g 均由乳腺中聚居的b 細(xì)胞產(chǎn)生和提 供。這些b 細(xì)胞屬于粘膜免疫系統(tǒng)( b r o w n 等，1 9 7 5 ) 。所以，初乳中的免疫球蛋白主 要由系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)來(lái)提供，而常乳中的免疫球蛋白主要由粘膜免疫系統(tǒng)來(lái)提供。 表3 牛乳和豬乳中免疫球蛋白的含量( m g m 1 ) t a b l e 3t h ea m o u n to fi m m u n o g l o b u l i n si nt h em i i ko fc o wa n ds o w 引臼b u r t o n 等( 1 9 8 9 ) 2 4 初乳中含有的其他保護(hù)和調(diào)節(jié)因子 2 4 1 免疫細(xì)胞 初乳中的免疫活性細(xì)胞有許多種，如t 淋巴細(xì)胞、b 淋巴細(xì)胞、臣噬細(xì)胞及嗜中 性顆粒細(xì)胞等，這些細(xì)胞能分泌特異的i g a 抗體，產(chǎn)生干擾素，或者表現(xiàn)直接的吞噬 作用，這對(duì)免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟的新生幼仔十分重要( c r a g o ，1 9 7 5 ：?jiǎn)位⒌龋? 9 9 8 ) 。 試驗(yàn)證明，母豬初乳中的淋巴細(xì)胞可被仔豬消化道吸收，增強(qiáng)仔豬的免疫力。r i e d e l c a s p a r i ( 1 9 9 1 ) 也認(rèn)為活的初乳淋巴細(xì)胞能通過(guò)腸壁，初乳白細(xì)胞是初乳加強(qiáng)新生犢 牛被動(dòng)免疫的主要成分。 2 4 2 非抗體保護(hù)蛋白 初乳中含有若干種非抗體保護(hù)蛋白，如抗胰蛋白酶因子，可保護(hù)免疫球蛋白不 被降解；乳鐵蛋白對(duì)鐵有高度親合力，可降低細(xì)菌對(duì)鐵的利用從而成為一種抑菌蛋 白；乳過(guò)氧化物酶系統(tǒng)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有廣泛的抑制作用( 鄒恩湘等， 1 9 8 9 ) 。這些非抗體保護(hù)蛋白可以彼此結(jié)合成復(fù)合體，或者與免疫球蛋白( 如i g g ) 相 結(jié)合，其結(jié)果使有關(guān)成分穩(wěn)定性增加，或產(chǎn)生出更強(qiáng)的抗菌效應(yīng)。 2 4 3 各種生長(zhǎng)因子 初乳中含大量的生物活性物質(zhì)，主要是多肽性生長(zhǎng)因子和類(lèi)固醇激素，基本分 為四類(lèi)； ( 1 ) 類(lèi)固醇激素，如雌二醇、腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇等； ( 2 ) 肽類(lèi)和蛋白質(zhì)激素，如促性腺激素、促甲狀腺素、胰島素、生長(zhǎng)激素等： ( 3 ) 前列腺素； ( 4 ) 多肽生長(zhǎng)因子，如i g f 、e g f 、t g f 、n g f 、e p o 、i l 等( 汪玉松和鄒思湘，1 9 9 5 ) 。 其可能的生物學(xué)作用見(jiàn)表4 。 表4 乳中生物活性物質(zhì)和可能的生物學(xué)功能 t a b l e 4g r o w t h s t i m u l a t i n gs u b s t a n c e si nm i l ka n dt h e i rp o s s i b l ef u n c t i o n 3 新生幼仔吸收外源性免疫球蛋白的意義和機(jī)制 哺乳動(dòng)物的新生幼仔即便它的自身免疫系統(tǒng)已經(jīng)比較完善，仍要從母親那旱獲 得抗體來(lái)被動(dòng)提高免疫力?？贵w的這種被動(dòng)傳遞主要通過(guò)胎盤(pán)或初乳進(jìn)行傳遞。母 源抗體傳遞給胎兒的方式取決于胎盤(pán)的類(lèi)型( 表5 ) 。靈長(zhǎng)類(lèi)為血絨毛膜胎盤(pán)，這種類(lèi) 型的胎盤(pán)允許l g g 由母體傳遞給胎兒，但i g m 、i g a 或i g e 則不能通過(guò)胎盤(pán)。狗、 貓為絨毛內(nèi)皮胎盤(pán)，這種類(lèi)型的胎盤(pán)允許部分i g g ( 5 - l o ) 通過(guò)，所以狗、貓的幼仔 也主要由初乳獲得被動(dòng)免疫力。偶躥類(lèi)家畜為結(jié)締組織絨毛膜胎盤(pán)，豬、馬為上皮 絨毛膜胎盤(pán)，母源抗體不能通過(guò)這兩種胎盤(pán)傳遞給胎兒，在幼仔出生時(shí)血清和腸道 分泌物中均不合免疫球蛋白。所以這兩種動(dòng)物就必須通過(guò)吮食初乳來(lái)獲得被動(dòng)的免 疫力( t i z a r d ，1 9 7 7 ) 。由于不同的動(dòng)物具有不同的轉(zhuǎn)移抗體的方式，所以這些動(dòng)物的 仞乳中i g g 、i g a 、i g m 的相對(duì)含量也不盡相同。 無(wú)論是對(duì)于保護(hù)胃腸道、還是系統(tǒng)免疫力，通過(guò)乳腺轉(zhuǎn)移免疫力對(duì)于各種哺乳 動(dòng)物的幼仔都是至關(guān)重要的。 各種家畜，腸道通透性的選擇性和通透時(shí)間長(zhǎng)短各不相同。腸壁對(duì)蛋白質(zhì)的通 透性在剛出生時(shí)為最高，然后迅速降低，大約在2 4 h 后降至最低水平。在初生的最 初幾個(gè)小時(shí)免疫球蛋白在新生幼仔的小腸內(nèi)沒(méi)有任何選擇性地通過(guò)小腸粘膜細(xì)胞 的胞飲作用被新生動(dòng)物吸收。l o g a h 等的研究指出。在出生后1 2 天內(nèi)，幼仔腸道 不僅能夠吸收同類(lèi)動(dòng)物的i g g ，也能吸收異類(lèi)動(dòng)物的i g g ，如奶牛初乳的i g o 在新 生羔羊的腸道中與羊初乳中i g g 有同樣快的吸收力。單虎等( 1 9 9 8 ) 的研究也指出， 太湖豬仔豬在哺喂牛初乳之后約8 h ，血液中就出現(xiàn)了較高水平的牛i g g 。 幼畜血清中免疫球蛋白水平一般在1 2 1 4 h 達(dá)到最高峰，以后隨著腸關(guān)閉( g u t c l o s s u r e ) 現(xiàn)象的出現(xiàn)，吸收終止。但嚙齒類(lèi)動(dòng)物卻有所不同，他們由腸道選擇性地吸 收i g g 的過(guò)程可持續(xù)2 0 天。 腸關(guān)閉的時(shí)間長(zhǎng)短因動(dòng)物品種的不同和免疫球蛋白種類(lèi)的不同而不同。引起腸 關(guān)閉的機(jī)制還不清楚。對(duì)任何一種動(dòng)物，只要在一定時(shí)間內(nèi)喂給初乳就能引起腸關(guān) 閉；應(yīng)激也能引起腸關(guān)閉；給大鼠注射可的松還能引起腸道提前封閉 ( k r e t e c h m er 1 9 8 3 ) 。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，新生仔畜小腸粘膜細(xì)胞的徽絨毛上覆蓋著大量密集 的液泡，出生后這些含有液泡的細(xì)胞逐漸擠靠微絨毛的頂端部位，同時(shí)微絨毛褶窩 內(nèi)的細(xì)胞有絲分裂增加，促進(jìn)了細(xì)胞移向微絨毛頂端大約出生后的3 天之內(nèi)，吸收 上皮細(xì)胞完全被成熟的上皮細(xì)胞所代替，腸關(guān)閉現(xiàn)象完成( s i m p o s o n m o r g a n ，1 9 7 2 ： s t a l e ya n d b u s h ，1 9 8 5 ：t r a n h a i ra n d r o b i n s o n ，1 9 8 9 ) 。還有報(bào)道說(shuō)，隨時(shí)陽(yáng)j 增長(zhǎng)， 腸道上皮細(xì)胞逐漸成熟和腸道菌群逐漸建立起來(lái)，使得腸道吸收外源免疫球蛋白的 能力逐漸降低直至消失( c h a p p u i s ，1 9 9 8 ) 。 4 幼仔被動(dòng)免疫失敗的原因 初生幼仔獲得的從母體傳遞來(lái)的抗體，在增強(qiáng)幼仔抵抗感染能力方面起著重要 的作用。( f e l s b u r g ，1 9 9 0 ：s t o k e s ，1 9 8 9 ；s h i f r i n e ，1 9 7 1 ) 。母獸初乳中免疫球蛋白 成功的傳遞給幼仔的前提條件有以下幾個(gè)：1 、母獸初乳中必須有足夠大濃度的免疫 球蛋白：2 、幼仔吸收消化足夠量的初乳：3 、免疫球蛋白通過(guò)腸道由初乳中被吸收 進(jìn)幼仔血液。以上3 個(gè)條件中任何一個(gè)發(fā)生問(wèn)題都會(huì)影響母獸初乳中免疫球蛋白的 被動(dòng)傳遞。 生產(chǎn)中總會(huì)出現(xiàn)由于母獸或幼仔的原因，或生產(chǎn)上的某些失誤而導(dǎo)致以上3 個(gè) 前提條件難以滿足，如有些優(yōu)良的種母畜母性不好，基本不帶仔，就會(huì)導(dǎo)致幼仔吃 不上或不能及時(shí)吃到初乳。大熊貓的實(shí)際生產(chǎn)中也經(jīng)常出現(xiàn)母獸棄仔或不帶仔的現(xiàn) 象使幼仔吃不到初乳或不能及時(shí)吃到、吃足初乳，從而造成抗體被動(dòng)轉(zhuǎn)移的失敗。 襲5 胎赧類(lèi)型與免接球蛋矗通過(guò)胎盤(pán)或斯乳進(jìn)行母癸傳遞的笑系 表5r e l a t i o n s h i pb e t w e e np l a c e n t a l t y p ea n d t r a n s f e r o f i m m u n e g l o b u l i n s f r o m d a m t o f o e t u j n e w b o r nv i ap l a c e n t ao rc o o s t r u m 引臼t i z a r do _ 缺乏+ = 存在+ + _ 士耍來(lái)源+ + + = 唯一來(lái)源 5 配方奶及免疫添加裁的應(yīng)用 5 1 嬰兒配方奶 母駝喂養(yǎng)是為嬰j l 健康生長(zhǎng)積發(fā)育提供理想食品的堆佳方法，假由于個(gè)人、社 會(huì)等外界因素的影響使母親的母乳不足或沒(méi)有母乳的情況客觀存在。在母乳不足或 沒(méi)有母乳的情況下，以前人佛用牛乳直接喂養(yǎng)嬰l 代替母乳，但兩卷的內(nèi)在成分存 在很大差異。母乳中蛋自質(zhì)主要是乳清蛋白，乳清蛋白與酪蛋白比率為6 。4 ，牛乳 中酷蛋自占總蛋白7 8 以上，高酪蛋白含量不利于嬰兒消化吸故。母乳中脂肪主要 是不飽和脂肪酸，并且臺(tái)有大量人體必需脂肪酸如亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸 f a a ) 。牛乳多是飽程脂肪酸，不利充分消化吸收。乳耱和礦物質(zhì)含量也存在差異， 牛乳咿物質(zhì)含量高，會(huì)增加?jì)雰耗I功能負(fù)擔(dān)，對(duì)嬰兒健康生長(zhǎng)不利。為了使缺乏母 乳喂養(yǎng)的嬰j l 健康生長(zhǎng)，人們茬牛乳的基礎(chǔ)上調(diào)整其能量稚營(yíng)養(yǎng)索，如去除部分酪 蛋白和飽和脂肪酸，添加部分乳清蛋白和不飽和脂肪酸，增加乳糖，降低礦物質(zhì)含 量，添加微量元素、維生器、某些氨基酸和其他成分，佳之與母乳接近，適合嬰l 的營(yíng)養(yǎng)需要和消化吸收而研制出母乳的替代品嬰兒配方奶粉。從菜種意義上說(shuō)嬰 l 配方奶粉的發(fā)展歷程就是模仿母乳他的過(guò)程。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，嬰兒配方奶粉大致經(jīng)歷如下過(guò)程： ( 1 ) 第一代嬰凡配方奶粉階段t 簡(jiǎn)單的向牛乳或煉乳加水稀釋?zhuān)欣谙痶 在牛乳中添加谷物、豆?jié){、蔗糖。 以增加熱量。 ( 2 ) 第二代嬰兒配方奶粉階段( 現(xiàn)階段配方嬰兒奶粉) ； 添加外源物質(zhì)，調(diào)節(jié)牛乳成分比例，如調(diào)節(jié)酪蛋白與清蛋白比例：提高不飽和 脂肪酸比例；強(qiáng)化缺乏的維生素、礦物質(zhì)：牛乳中添加脫鹽乳清粉、淀粉糖、維生 素、礦物質(zhì)、植物油、?；撬?、低聚糖、d h a ，提高腸道內(nèi)雙岐桿菌數(shù)量，促進(jìn)喂 養(yǎng)嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。 ( 3 ) 第三代嬰兒配方奶粉( 完善階段) ： 以乳清蛋白( 如d 乳球蛋白) 水解物為基礎(chǔ)，經(jīng)抑菌處理添加免疫活性物質(zhì)，保 證嬰兒正常生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需要，提高喂養(yǎng)兒機(jī)體免疫力和抗感染力。 雖然隨著技術(shù)的發(fā)展，配方奶粉的成分與母乳越來(lái)越接近，但目前還沒(méi)有一種 產(chǎn)品能與母乳成分完全一致。 s 2 免疫添加劑的應(yīng)用 實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)常會(huì)因?yàn)槟斧F母性不強(qiáng)不愿哺乳，或初乳不足，或者幼仔身體太 弱等原因而導(dǎo)致幼仔難以吃到足夠初乳，通常會(huì)用牛乳或奶粉的方法進(jìn)行補(bǔ)救，這 樣做雖然可以起到一定的作用，但存在很多問(wèn)題。其一是牛乳對(duì)于其他的動(dòng)物來(lái)說(shuō) 消化性存在差異，很多動(dòng)物直接飼喂牛乳會(huì)引起腹瀉，甚至死亡。其二是牛乳與其 他動(dòng)物的初乳相比所含營(yíng)養(yǎng)成分不同，即使幼仔喂牛乳后存活下來(lái)，對(duì)其以后的生 長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能也會(huì)產(chǎn)生影響。其三是牛乳中不含免疫球蛋f l ( 抗體) ，這是造成 補(bǔ)喂牛乳的動(dòng)物死亡的一個(gè)重要原因。 用免疫球蛋白對(duì)代初乳和斷奶后的日糧進(jìn)行強(qiáng)化，來(lái)解決代初乳中免疫球蛋白 缺乏的問(wèn)題。大量關(guān)于大型動(dòng)物的研究資料證明，血清中的i g g 濃度是用來(lái)評(píng)價(jià)幼仔 抵抗感染的最好的指標(biāo)，( b a l d w i n ，1 9 9 1 ；c l a b o u g h ，1 9 9 1 ：r e ad e ，1 9 9 6 ；g a l e ， 1 9 9 8 ：v i i r t a l a ，1 9 9 9 ) 。所以在應(yīng)用外源免疫球蛋白的時(shí)候，多以添d i i g g 來(lái)強(qiáng)化代 初乳。r a i n a r d ( 1 9 8 6 ) 報(bào)道，血清免疫球蛋白可在體外抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)：d r e w ( 1 9 9 9 ) 也報(bào)道，血清免疫球蛋白可抑制輪狀病毒的生長(zhǎng)，這表明，m 清中免疫球蛋白可在 機(jī)體局部( 腸道) 抑制腸道病原菌的侵襲。 應(yīng)用豬血清免疫球蛋白的試驗(yàn)結(jié)果表明，血清免疫球蛋白對(duì)人工飼養(yǎng)的豬確實(shí) 可以提供腸道的局部保護(hù)作用( m c e a l l u m 等，1 9 7 7 ) 。 d r e w 和o w e n ( 1 9 8 8 ) 報(bào)道，從動(dòng)物血液中提取免疫球蛋白制成人工初乳喂給新生 o 羔羊和初生仔豬，可使羔羊的死亡率由1 9 降到7 ，仔豬的死亡率山1 7 降到5 ， 能有效防止幼仔的各種傳染性疾病，并能促進(jìn)幼畜的生長(zhǎng)發(fā)育。 提純血清中的i g g 有多種方法，如鹽析法、凝膠過(guò)濾、離子交換層析、親和層析 以及高效液相色譜等方法。不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)純度要求，技術(shù)力量和實(shí) 驗(yàn)室具體條件加以選擇。 提取i g g 的步驟比較繁瑣，要求條件嚴(yán)格，而且容易在提純操作中造成免疫球蛋 白變性和污染，并且生產(chǎn)實(shí)際中要應(yīng)用到的i g g 量較大，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施來(lái)提純的小劑量 i g g 難以滿足生產(chǎn)需要。b u r t o n ( 1 9 8 1 ) 、h e a t h ( 1 9 8 5 ) _ 手l l v e v m ，t l ( 1 9 9 1 ) 等將血清或i g g 純品添加到人工乳中或注射到幼仔體內(nèi)，有效提高了新生幼仔的抗病力，減少了傳 染性疾病的發(fā)生，并提高其成活率和育成率。w e l l 等( 1 9 7 4 ) 總結(jié)出的注射血清法可以 提高鼻分泌液的抗體滴度，從而提高抗呼吸道病毒感染的能力。j u l i ek 等( 2 0 0 1 ) 將 貓血清皮下注射和腹腔注射到未食初乳的初生貓?bào)w內(nèi)，有效的提高了初生貓血清中 的i g g 水平。a r t h i n g t o nj d 等( 2 0 0 2 ) 飼喂牛血清給初生犢牛，與飼喂初乳的犢牛進(jìn)行 對(duì)照，出生后2 4 h 檢測(cè)結(jié)果，飼喂牛血清的犢牛對(duì)i g g 的吸收率要高于飼喂初乳組， 得病率也相對(duì)較低。h u n te 等( 2 0 0 2 ) 、q u i g l e yj d 等( 2 0 0 2 ) 的研究也證明將牛血清給 犢?？诜行У奶岣吡藸倥５目共×?。 但應(yīng)用血清也存在缺點(diǎn)，如血清不易保存，易污染，而且適口性差，所以至今 尚未形成新產(chǎn)品。 6 大熊貓的概況 眾所周知，大熊貓( a i l u r o p o d a m e l a n o l e u e a ) 是中國(guó)特產(chǎn)瀕危珍稀動(dòng)物，被認(rèn)為是 哺乳類(lèi)多樣性的重要組成部分，同時(shí)大熊貓又具有很高的觀賞和科研價(jià)值。由于大 熊貓繁殖力低、棲息環(huán)境不斷縮小和割裂、遺傳交流中斷、人為干擾等原因，野外 大熊貓的數(shù)量急劇減少，已瀕臨滅絕。應(yīng)當(dāng)說(shuō)大熊貓淪為瀕危物種的原因是多方面 的，其中之一便是它自身遺傳因素和繁殖存活率低下對(duì)擴(kuò)大種群數(shù)目的影響。 太熊貓懷孕的前2 3 時(shí)間胚胎在子宮內(nèi)游離而不著床，新生幼仔發(fā)育極不完全。 體重僅為母親的1 9 0 0 ，從而大大降低幼仔對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。大熊貓幼仔在初生時(shí) 本身免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對(duì)外界致病因素的抵抗能力很差，極易感染疾病且治愈 率很低，最終導(dǎo)致死亡。 近十年來(lái)，大熊貓的育幼工作取得了很大進(jìn)展，如雙胞胎育幼成功、人工輔 助育幼及全人工育幼等方法的引入，大大地提高了大熊貓幼仔的成活率，但從整體 來(lái)看，大熊貓幼仔的成活率依然較低，在1 9 9 0 年以蒔，大熊貓幼仔到半歲的存活率 為僅3 3 9 1 ，1 9 9 0 年以后達(dá)到6 6 8 8 ，總計(jì)為5 2 7 9 ；特別是人工輔助育幼及全 人工育幼幼仔容易患各種感染性疾病，成活率明顯低于全母獸哺育幼仔，以在成都 動(dòng)物園及成都大熊貓繁育研究基地出生的大熊貓幼仔為例，在1 9 9 4 年以后出生并發(fā) 生死亡的共有1 0 只大熊貓幼仔，其中9 0 為人工輔助以及全人工育幼仔，其中有 6 0 死于各種感染性疾病，另外4 0 死于各種意外事故，( 如被母獸壓死、出生h , t 目p 已死亡及不明原因的呼吸驟停等) 。就是在目前已存活的大熊貓中，在其育幼過(guò)程中 也有多例發(fā)生是過(guò)呼吸道、消化道感染后經(jīng)搶救成活?？梢?jiàn)提高大熊貓初生幼仔免 疫力成為提高大熊貓存活率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 全人工育幼難究其原因，除大熊貓初生幼獸的自身免疫水平非常低外( 王平等， 1 9 8 0 ；1 9 8 3 ；m o n t a l ir j 等，1 9 9 0 ) ，主要由于大熊貓初乳尚遠(yuǎn)不能滿足育幼需要， 而人工初乳中特異性免疫物質(zhì)還不能從根本上得到解決( 鐘順隆等，1 9 9 3 ) 。目前對(duì) 大熊貓?zhí)ケP(pán)的類(lèi)型還沒(méi)有進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)研究，其胎盤(pán)屬于那種類(lèi)型還沒(méi)有一個(gè)定論， 但大熊貓幼仔通過(guò)哺喂初乳而獲得堅(jiān)強(qiáng)免疫力在大熊貓育幼生產(chǎn)中已成為共識(shí)。北 京動(dòng)物園在人工初乳中首次加入一定劑量的免疫球蛋l(fā) 白( i g g 、i g a 、i g m ) ，全人工育 幼未食過(guò)母體初乳的大熊貓初生幼獸，獲得了一定的效果( 劉維新等；1 9 9 3 ) ，間接 證明了母體初乳的重要性，但所加抗體物質(zhì)的種類(lèi)和含量也僅根據(jù)多年人工育幼經(jīng) 驗(yàn)和大熊貓初生幼獸的生物學(xué)特點(diǎn)，缺少理論依據(jù)。盡管用大熊貓剩余初乳配制成 人工乳哺育幼獸獲得了成功( 鐘順隆等，1 9 9 6 ) ，但由于大熊貓初乳的采集具有相當(dāng) 大的危險(xiǎn)性，而且又需要產(chǎn)仔的同步性以及足夠的產(chǎn)乳量，此方法尚難以滿足生產(chǎn) 需要。因此目前大熊貓全人工或人工輔助育幼面臨的最大問(wèn)題之就是如何提高幼 仔的免疫力。 7 國(guó)內(nèi)外概況 目前，在人類(lèi)以及動(dòng)物如馬、狗上，人們都曾研制出血液球蛋白以補(bǔ)充自身的 免疫球蛋白不足來(lái)增強(qiáng)對(duì)疾病抵抗力。在人，免疫球蛋白的替補(bǔ)療法已成為一種常 規(guī)的手段，有人對(duì)1 5 例極低體重兒應(yīng)用0 5 0 7 9 k g 體重靜脈注射人血球蛋白，可 以起到明顯的防止感染作用，卻無(wú)明顯的副作用。對(duì)體重小于1 5 0 0 9 ，胎齡小于3 4 周的高危新生兒，每月應(yīng)用o 5 9 k g 體重免疫球蛋白預(yù)防，其感染的發(fā)生率、敗血 癥發(fā)生率和病死率均較未應(yīng)用預(yù)防組有明顯的減低。有人提出大熊貓初生幼仔類(lèi)似 于人類(lèi)的早產(chǎn)兒，王成東等檢測(cè)了大熊貓血液及乳中免疫球蛋白種類(lèi)與含量，華盛 頓國(guó)家動(dòng)物園r i c h a r d j 等采用電泳技術(shù)檢測(cè)了初生大熊貓幼仔的血清，發(fā)現(xiàn)球蚤白 帶較少，在注射了成年大熊貓血液中提耿的球蛋白后，其球蛋白帶明顯增多，但是 由于注射了大熊貓球蛋白的幼仔在子宮內(nèi)已發(fā)生感染，大熊貓幼仔僅存活三天后死 亡。因此國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)系統(tǒng)的關(guān)于注射用大熊貓血液球蛋白的研制與應(yīng)用研究。 8 本研究的目的和意義 對(duì)大熊貓這一古老物種而言。，靠母乳哺育固然相當(dāng)理想，它不僅含有幼仔生長(zhǎng) 發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且還含有特異性的免疫物質(zhì)，成為幼仔最早獲得的被動(dòng) 免疫。但事實(shí)證明，靠大熊貓初乳來(lái)哺育初生幼仔己遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足育幼工作的需要， 將大大阻礙大熊貓圈養(yǎng)繁殖增加數(shù)量、擴(kuò)大種群和延緩滅絕。為此有關(guān)學(xué)者進(jìn)行了 諸多嘗試，如給大熊貓幼仔口服人血球蛋白補(bǔ)充外源性抗體，補(bǔ)充山羊、貓、狗仞 乳，但都未收到預(yù)期效果。究其原因可能因?yàn)樘峁┛贵w的物種與大熊貓相比物種差 距太大，不同物種對(duì)不同疾病的易感性不同，因此用其它物種提供的抗體并不能對(duì) 大熊貓幼仔提供有效的保護(hù)。另一方面，比如采用人血球蛋白，本柬應(yīng)肌注，但因 來(lái)源于異種蛋白，可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)而只能口服，但是人血球蛋白在消化道中容 易被消化酶破壞而起不到應(yīng)有的作用。因此采用同種抗體柬被動(dòng)提高大熊貓幼仔的 免疫力成了唯一的選擇。 在選擇大熊貓的免疫添加劑的問(wèn)題上，準(zhǔn)備選用大熊貓血清來(lái)提供被動(dòng)免疫用 的i g g ，因?yàn)樘峒僫 g g 的過(guò)程對(duì)操作環(huán)境要求嚴(yán)格，在操作過(guò)程中可能由于條件的 變化或控制不嚴(yán)格而造成i g g 變性、污染等，血清處理過(guò)程中微量的藥物殘留對(duì)脆 弱的大熊貓幼仔可能都將是致命的。而且大熊貓血清量有限，目前的提純i g g 的方 法并沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)大熊貓的，還需要進(jìn)行條件摸索，所以很容易造成對(duì)寶貴大熊貓 血清的浪費(fèi)。在不充分了解大熊貓的血液生理生化機(jī)理以及生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理的情況下， 應(yīng)用大熊貓血清作為免疫添加劑是一個(gè)較好的選擇，因?yàn)閬?lái)自母親血清中的除抗體 之外的其它物質(zhì)，如自蛋白等通過(guò)腸道進(jìn)入幼仔血液，可能也會(huì)對(duì)幼仔的某些機(jī)能 提供一定幫助。 本研究的目的是尋找與大熊貓母乳成分相似的代用乳飼喂幼仔，減少對(duì)幼仔脆 弱腸道的刺激，并提供足夠的營(yíng)養(yǎng)。目前在大熊貓的育幼實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)整某些 奶粉的成份可以模擬大熊貓母乳成份。不同單位采用了不同配方，但是不清楚哪種 配方更接近大熊貓母乳，目前已經(jīng)收集了相關(guān)配方，進(jìn)行比較研究，以確定與大熊 貓母乳成分相似的代用乳配方。 選擇合適的血清處理方法，在繁殖季節(jié)，在麻醉健康成年大熊貓進(jìn)行采精和配 種時(shí)抽血，分離血清保存，并檢測(cè)成年大熊貓和初生幼仔血清中各蛋白組成的含量， 確定以f f 清作為免疫添加劑的添d nt = j j 量，為大熊貓仞生幼仔實(shí)際應(yīng)用血清制品以被 動(dòng)提高大熊貓幼仔的免疫力做好前期準(zhǔn)備。 試驗(yàn)一大熊貓初生幼仔腸道正常菌群的檢測(cè) 1 試驗(yàn)?zāi)康?圈養(yǎng)條件下，大熊貓幼仔及亞成體易患腹瀉，人t 孚l , f f ：養(yǎng)的個(gè)體以及脫離母乳 喂養(yǎng)進(jìn)入亞成年生長(zhǎng)期的個(gè)體，出于食物及環(huán)境條件改變，腹瀉發(fā)病率更高，這與 不清楚大熊貓幼仔腸道f 常菌群組成情況有密切關(guān)系。特別是不了解仞生大熊貓幼 仔生長(zhǎng)過(guò)程中腸道正常菌群的“演替”情況，對(duì)這一階段薩確防治疾病、確保幼仔 成活等造成一定困難。 成都大熊貓繁育研究基地2 0 0 3 年繁殖的大熊貓由于母獸母性好、育幼經(jīng)驗(yàn)豐富 且均為單胎，所以人工干預(yù)育幼少，幾乎為全母親育幼。幼仔可以說(shuō)是在人工圈養(yǎng) 條件下所能達(dá)到的最好的育幼條件下生長(zhǎng)的，這為我們研究初生幼仔腸道正常菌群 提供了很好的機(jī)會(huì)。 本試驗(yàn)的目的就是檢測(cè)大熊貓初生幼仔腸道f 常菌群的組成及建立過(guò)程，為今 后評(píng)價(jià)新的代用乳效果和腹瀉病的診斷打下基礎(chǔ)。 2 材料方法 2 1 供試動(dòng)物 成都大熊貓繁育研究基地2 0 0 3 年出生的3 只幼仔，健康，采樣i 口未迸行過(guò)抗生素 處理，主要食物為母乳。 2 2 標(biāo)本采集 用無(wú)菌器械采集幼仔糞便后，立即放入預(yù)先消毒滅菌、稱(chēng)重、裝有i m l d h 7 4 硫 1 4 乙醇酸鹽( 0 1 5 硫代乙醇酸鈉，0 1 1 磷酸氧二鈉，0 i 氯化鈉，00 0 9 氯化鈣) 轉(zhuǎn) 運(yùn)r 勺塑料離心管中，振搖均勻，稱(chēng)重，計(jì)算標(biāo)本的蓐量。直刻拿到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢 驗(yàn)。每只幼仔自出生后每天取樣，但由于是母獸療幼，所以母獸會(huì)舔拭幼仔肛周刺 激排便并吃食幼仔糞便，所以不可能每滅在從母獸處墩出時(shí)都采集到糞樣。 2 3 培養(yǎng)基 b l o o dh e a r t i n f u s i o f i ( b h i ) 培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂平皿、乳桿菌培養(yǎng)基等，以 上培養(yǎng)基均為商品化成品。 2 4 微生物培養(yǎng)及鑒定 2 4 1 微生物培養(yǎng) 根據(jù)稱(chēng)重結(jié)果將待檢糞便用生理鹽水稀釋成1 0 。稀釋度，從中取0 i m 加o 9 m l 塵理赫水稀釋搖勻此為l o 。稀釋度，此方法連續(xù)稀釋到直至l 0 “。 用滴點(diǎn)法接種于r h t 培養(yǎng)基上( 4 8 滴m ) ，每份樣品，每個(gè)濃度接種：3 滴。以上操 作均在無(wú)菌條件下完成。3 7 。c 下倒置培養(yǎng)4 8 h 。培養(yǎng)后根據(jù)菌落的外觀、顏色等進(jìn)行 初步鑒定，然后再分別接種到麥康凱、乳酸卡t 菌培養(yǎng)基等專(zhuān)性培養(yǎng)基上培養(yǎng)。后根 據(jù)初步具體的檢測(cè)結(jié)果將部分稀釋液直接滴點(diǎn)接種于不同專(zhuān)性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。 其中麥康凱平皿培養(yǎng)需氧下3 54 c 培養(yǎng)2 4 h ，乳桿菌菌培養(yǎng)基為厭氧3 7 。c 培養(yǎng)4 8 h 。 2 4 2 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定 取出培養(yǎng)皿，觀察各培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況，挑選相同菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)、染色， 生化鑒定按伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)( 第九版) 及- - 般細(xì)菌常用鑒定方法進(jìn)行。 3 結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附表。 從檢測(cè)結(jié)果可以看出：l 、初生大熊貓幼仔腸道中菌群以大腸埃希氏菌、糞鏈球 菌為主，1 開(kāi)齡幼仔的糞便中檢測(cè)到了大腸埃希氏菌和表葡萄球菌，2 r 齡時(shí)即可檢 測(cè)到糞鏈球菌。從整個(gè)檢測(cè)結(jié)果可以看出表皮葡萄球菌可能為環(huán)境污染，辦或因?yàn)?母獸舔拭幼仔從而使幼仔肛周或排便時(shí)帶有表葡菌，而非幼仔腸道內(nèi)的菌群。2 、卜3 5 閂齡大熊貓幼仔腸道中的優(yōu)勢(shì)菌為大腸埃希氏菌、糞鏈球菌。這期間糞便中菌群較 為單純，基本沒(méi)有什么變化，在2 5 閂齡時(shí)爿檢n n - 卡t 菌，但也是微量。3 、應(yīng)用抗 生素使幼仔腸道內(nèi)菌群完全消失。在6 天后可檢測(cè)到大腸埃希氏菌，但與其它幼仔相 比，菌群組成中比較單一，沒(méi)有糞鏈球菌。 4 討論與分析 1 、在】1 齡的大熊貓幼仔糞便中即州檢測(cè)到大腸埃希氏菌，其麗群米源。叮能為 母獸懷抱幼仔不停舔拭，從而使口腔中細(xì)菌進(jìn)入幼仔消化道：也口j 能因?yàn)橛鬃性谀?獸懷抱中時(shí)或吃食初乳時(shí)環(huán)境中的細(xì)菌進(jìn)入口腔從而進(jìn)入消化道。幼仔糞便中的菌 群組成很單一，以大腸埃希氏菌為主，糞鏈球菌次之，這與以前關(guān)r 成年大熊貓和 大熊貓幼仔腸道f 常菌群的報(bào)道相似( 張志和、何光昕1 9 9 5 ，1 9 9 7 ：) 。在2 5 同齡后 出現(xiàn)乳桿菌，但含量很低，此后又進(jìn)行了不定期的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在此后較長(zhǎng)f i e f j 內(nèi)( f i o d ) 除去有時(shí)可檢測(cè)到表皮葡萄球菌、萘瑟氏菌等過(guò)路菌外，糞便菌群組成基本沒(méi)有變 化。在整個(gè)試驗(yàn)中一直沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌，這與文獻(xiàn)所報(bào)道幼仔腸道菌群以雙歧桿 菌為最優(yōu)勢(shì)菌不同( 張志和、何光聽(tīng)，1 9 9 7 ) ，原因不清楚。而且厭氧菌含量雖然后 來(lái)有所增長(zhǎng)，但不是主要的組成部分，這與成年大熊貓腸道中需氧菌檢出量及檢出 率相對(duì)較高，而厭氧菌的種類(lèi)及數(shù)量相對(duì)較少相吻合( 張志和，1 9 9 5 ) 。 2 、微生念學(xué)研究表明，盡管人和動(dòng)物胃腸道l f 常菌群的原籍苗及需氧菌和厭氧 菌的比例有一定的差異，但其中9 5 以j i 的細(xì)菌為生理性號(hào)性厭氧菌( 魏曦，1 9 8 5 ； 康白，1 9 8 8 ) ，但本試驗(yàn)中大熊貓仞塵幼仔腸道中菌群組成卻不同，排除系統(tǒng)和偶然 誤差，客觀上可能這就是大熊貓?jiān)揻 1 齡段的腸道菌群的特點(diǎn)，也可能與其消化道短， 進(jìn)食頻繁、腸道蠕動(dòng)快等原因有關(guān)。 3 、從微生態(tài)學(xué)角度出發(fā)，f 常情況下處于微生念平衡之中的正常菌群成員是不 致病的，但不利的內(nèi)外環(huán)境因素破壞了生態(tài)平衡，造成其中一種或數(shù)種菌優(yōu)勢(shì)繁殖， 則成為致病菌( 條件性致病菌) ：或使其中數(shù)量少，但f 常情況下因其它微生物的拮 抗或機(jī)體免疫屏障等方面的作用不足以致病的致病菌大量生長(zhǎng)繁娘，電可引起機(jī)體 發(fā)病。本試驗(yàn)中采集到一只幼仔( 6 同齡) 在應(yīng)用抗生素后的糞便，經(jīng)培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)， 證剛抗生素己將腸道內(nèi)的菌群全部殺滅，在6 d 后采集糞便再做培養(yǎng)，僅發(fā)現(xiàn)大腸埃 希氏菌，與相似同齡的其它幼仔相比組成較單一，證明腸道內(nèi)菌群在被全部殺滅后 重新慢慢建立起來(lái)。對(duì)人及動(dòng)物的大量研究已經(jīng)證實(shí)，菌群失調(diào)是某些疾病特別是 腹瀉病的本質(zhì)病因，在圈養(yǎng)條件下大熊貓辦是如此，腹瀉病列大熊貓幼仔的威脅尤 其大( 仇秉興，1 9 8 4 ；馮文和等，1 9 8 7 ：胡錦矗，1 9 8 8 ；鐘順隆等，1 9 9 3 ) 。腸道菌 群的建立與個(gè)體、遺傳、環(huán)境、食物等因素有關(guān)，所以在應(yīng)用抗生素后菌群被嚴(yán)重 破壞，在重新建立菌群的過(guò)程中難免會(huì)因食物組成、食量、環(huán)境等的改變而造成某 些菌群的失調(diào)從而導(dǎo)致腹瀉等疾病。對(duì)初生幼仔建矗k 期的腸道埔群峪測(cè)制度，尤 其足在試用新的食品配方或 = r 4 喂力式時(shí)這種制度刈f 幼和疾病珍斷虹具有重要意 義。在抗生素的應(yīng)用上，應(yīng)根據(jù)各病的具體情況選擇弄目應(yīng)敏感抗生素，以免造成腸 道菌群被大部分或全部破壞從而加大菌群失調(diào)的危險(xiǎn)。 4 、影響f 常菌群的因素很多，除技術(shù)、遺傳、食物等因素外，同齡及采樣時(shí)削 與測(cè)定結(jié)果密切相關(guān)。在一般情況卜，大熊貓母獸哺育時(shí)常常將幼仔糞便舔食掉， 且幼仔排便時(shí)i 刈不固定，多導(dǎo)致無(wú)法采樣，使同齡及采樣時(shí)| h j 刈測(cè)定結(jié)果的影響無(wú) 法控制，致使試驗(yàn)定量檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)較大。如果條f t ：允許還應(yīng)擴(kuò)大試驗(yàn)樣本數(shù)， 并對(duì)菌群定位等作進(jìn)一步研究。 附表：檢測(cè)結(jié)果 備注：表示沒(méi)檢測(cè)山。十為6 曰齡時(shí)所檢測(cè)的樣本岡為在取樣的前一大發(fā)生腹瀉麻刪抗 e 素治療，經(jīng)檢測(cè)糞便中無(wú)細(xì)菌。12 曰齡檢測(cè)的是與6 日齡時(shí)檢測(cè)的同一只幼仔。 試驗(yàn)二大熊貓代用乳的選擇 1 試驗(yàn)?zāi)康?為了能配制出與母乳成分盡可能千目似的人： 乳，使大熊貓幼仔可以從人工乳中 獲得生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)并狹得舉強(qiáng)免疫力，國(guó)內(nèi)外的大熊貓研究人負(fù)對(duì)大熊貓乳汁成 分作了一定的研究，對(duì)大熊貓乳汁成分有了一定的了解，但山于所能得到的用于研 究的乳樣的量比較少，實(shí)驗(yàn)得不到重復(fù)，得出的結(jié)論受個(gè)體差異，采樣時(shí)問(wèn)等具體 因素的影響，很難當(dāng)作權(quán)威結(jié)論來(lái)應(yīng)用，但這些研究也為人工乳的配制打 f 了一定 的基礎(chǔ)。目自h 可以肯定的是大熊貓乳的成分與幾種常見(jiàn)乳差異還是比較大，如表1 表l 兒種常見(jiàn)乳與人熊貓乳營(yíng)養(yǎng)成分的比較( w ) t a b l e lc o m p a r i s a t i o no f n u t r i t i o n a lc o m p o s i t i o n ga m o n gc o m m o nm i l k sa n dg i a n tp a n d am i l kf w 、 乳樣 w a t a t c pe el a ca s hc apg e 人熊貓( g i a n tp a n d a ) 8 4 3 50 873 3 10 7o 8 90i 2 40 1 0 51 0 1 人熊貓( g i a n tp a n d a ) 70 5 o 2 9 8 8 2 人h u n m a n i i58 1349 l0 0 2 3 30 0 1 151 0 l 成都麻芋g o a t 5 2 966 64 0 30 1 6 0 12】0 2 狗d o g 7 5 41 l ，29 63 10 7 303 2 502 2 21 6 4 奶牛c o w 8 723 5374 907 l0 1 2 10 0 9 57 5 引口劉選珍( 1 9 9 6 ) 黑熊( s e l e n a r c t o st h i b e t a n u s ) 與大熊貓均屬食肉目熊超科的物種，但對(duì)大熊貓與熊 科物種間的親緣關(guān)系及其分類(lèi)地位仍有眾多爭(zhēng)議。o b r i e n 等( 1 9 8 5 ) 根據(jù)對(duì)大熊貓 和熊科物種的染色體( 包括x 染色體在內(nèi)) g 帶帶型分析，并結(jié)合分子方面的證據(jù)， 認(rèn)為人熊貓介于熊和浣熊之b j ，更接近熊。：e 希成等( ) 9 8 8 ) 從免疫學(xué)角度探討火熊 貓的親緣關(guān)系，認(rèn)為大熊貓與黑熊更接近。 黑熊與大熊貓的初生幼仔部十分弱小，且生長(zhǎng)發(fā)育在初期相當(dāng)長(zhǎng)段時(shí)陽(yáng)j 都依 賴(lài)母乳?？赡芏叩娜橹卸几缓承?duì)發(fā)育不成熟幼仔的生長(zhǎng)發(fā)育有幫助的因子。 國(guó)外對(duì)黑熊、北極熊等熊的乳汁進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)其乳汁成分與大熊貓有定的相 似性，如乳糖含量相對(duì)較低，蛋白含量高( o l a v e ，1 9 9 3 ) ，以及認(rèn)為乳中某些特殊結(jié) 構(gòu)的寡糖對(duì)免疫功能有一定的刺激作用等( t a d a s u ，2 0 0 0 ；t a d a s h i ，2 0 0 0 ) 。綜上所述， 我們有必要把黑熊乳當(dāng)作- i 中考慮的代用乳選擇，并在前人研究工作的基礎(chǔ)上，更加 深入的分析大熊貓與黑熊初乳及常乳的成分，對(duì)比二者的相似性及區(qū)別。 同時(shí)，綜合國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家針對(duì)大熊貓的研究，以及國(guó)內(nèi)外對(duì)大熊貓人工育幼的實(shí) 踐經(jīng)驗(yàn)，我們得到其它l 個(gè)大熊貓人工乳的配方。如北京動(dòng)物園報(bào)道的在初乳期( 出 生后1 3 天) 哺喂幼仔人t 乳，取得較好效果，初乳期人工乳基礎(chǔ)配方為熊貓奶粉 ( p a n d am i l k ) ：狗初乳= 1 ：1 ( 質(zhì)量比) ：還有圣迭哥動(dòng)物園的配方：狗奶f , a ( g s b i l a c p o w d e r ) ：人嬰兒奶粉( e n f a m i lp o w d e r ，l o w i r o n ) ：水= l ：1 ：6 ( 體積比) ；以及基r 成都 大熊貓繁育研究基地現(xiàn)用配方所做的修改：l l i 羊仞乳：熊貓奶粉( p a n d am i l k ) ：去離 子水= 3 ：1 ：6 ( 質(zhì)量比) ，分別記為人工乳i 、人i 乳2 、和人工乳3 。 本試驗(yàn)的目的在于，分析現(xiàn)有配方以及