DNA指紋圖譜技術在土壤微生物多樣性研究中的應用pace等于1986年首次利用rrna基因確定環(huán)境樣品中的微生物，通過對5s rrna基因的序列分析來研究微生物的生態(tài)和進化。該方法很快被用于微生物多樣性研究領域。由于5s rrna基因相對較小，攜帶信息相對較少，因而揭示微生物群落多樣性的能力有限。相比之下，隨后開展的16s rrna基因序列分析為微生物多樣性研究提供了更多信息，且效率更高。目前16s rrna基因序列分析已廣泛應用于微生物多樣性的研究。16s rrna基因序列分析是主要基于已建立的微生物16s rrna基因序列數(shù)據(jù)庫，用以確定細菌的系統(tǒng)發(fā)育關系，并使序列探針用于識別未知菌成為可能。當然序列探針的確定也可根據(jù)分子標記方法，如rapd方法進行。利用16s rrna基因序列研究微生物多樣性可采用不同的策略。目前一般常用以下幾種方法。一、變性梯度凝膠電泳（dgge）和溫度梯度凝膠電泳（tgge ）1993年muyzer等將dgge技術引入環(huán)境微生物學多樣性的研究。隨后該技術被廣泛用于比較不同生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落的多樣性及監(jiān)測特定微生物種群的動態(tài)變化，dgge和tgge的原理是根據(jù)含有不同序列的dna片段（16s rrna基因擴增產物）在具有變性劑梯度或溫度梯度的凝膠上由于其解鏈行為的不同而導致遷移率的不同，部分解鏈的dna片段在凝膠中的遷移速率低于完全螺旋形式的dna分子，從而含有不同堿基序列的dna片段就得到有效分離。結合pcr擴增標記基因或其轉錄物（rrna和mrna）的dgge方法能直接顯示微生物群落中優(yōu)勢組成成分。由于它可同時對多個樣品進行分析，使之非常適合研究微生物群落的時空變化，而且可以通過對酶切條帶進行序列分析，或通過與獨特的探針雜交鑒定群落組成，可以方便地了解環(huán)境被干擾后的微生物群落變化或某種指示微生物的命運。oliver等用dgge方法考察了農田微生物的變化情況，認為環(huán)境變化對農田微生物的多樣性有很大影響。但是dgge/tgge技術也存在一定的局限性。其缺陷之一是只能分離約500 bp大小的dna片段，這限制了作為下一步用于雜交分析的探針設計。并且研究報道有些種類細菌16s rdna在dgge上不只顯示1條帶，而不同種細菌的16s rdna序列在dgge上也可能因為具有相同的解鏈行為而不能被分開。即便存在以上的一些局限性，dgge/tgge仍是分析微生物群落多樣性較為敏感的方法之一。二、單鏈構象多態(tài)性（sscp）sscp是對16s rrna基因擴增產物進行分析的另一種簡便有效的方法。該技術最初用來檢測人類dna的基因多態(tài)性，lee等在1996年首次報道將sscp技術應用到環(huán)境樣品微生物群體多樣性分析。不同堿基序列的單鏈dna分子構象不同，dna片段變性成單鏈后受到凝膠不同分子篩作用力最終使不同dna片段得到分離。電泳結束后可以將不同的條帶切下并測序，或采用特異性探針進行雜交，進而顯示該特定微生物類群的動態(tài)變化。holly等利用sscp技術研究發(fā)現(xiàn)在植物根際土壤中大量存在古菌crenarchaeot，該類微生物以往一直被認為只存在于極端嗜熱環(huán)境當中。但是sscp技術重現(xiàn)性較差，易受膠濃度和電泳溫度等條件的影響。另外，sscp能夠有效分離的dna序列過短，為150-400 bp。三、隨機引物擴增多態(tài)性dna（rapd ）由williams建立的rapd技術，因具有操作簡便、快速和經濟等優(yōu)點而得到了廣泛應用。該技術以隨機寡核苷酸（5-10 nt）作為引物，擴增得到的多態(tài)性片段較短，更方便檢測兩個同源或異源等位基因的有無，適用于種內和亞種更為細致的分類。張巒等在室內培養(yǎng)條件下，采用rapd分子標記技術研究了重金屬鎘和多環(huán)芳烴菲復合污染對土壤中微生物群落dna序列多樣性的影響。結果表明，培養(yǎng)15 d和30 d后，鎘-菲單一和復合污染均導致土壤微生物群落dna序列的豐度、均度和多樣性指數(shù)增加。重復性不好是該技術存在的主要問題，而dna模板的質量與數(shù)量、mgcl2和引物濃度的變化都有可能導致得到不同的圖譜。另外，從條帶圖譜中無法得到任何微生物系統(tǒng)發(fā)育信息。四、限制性片段長度多態(tài)性（rflp ） 和擴增核糖體dna限制性分析rflp方法和ardra方法也常用于微生物群落的分析。通常用引物pcr擴增得到16s rdna片段，被限制酶切割，然后再進行電泳形成不同長度的片斷進行分析。其所獲得的譜帶更為簡單，易于分析，不受菌株是否純培養(yǎng)的限制，不受宿主的干擾，具有特異性強，效率高的特點。廣泛應用于新物種的發(fā)現(xiàn)、微生物分類及鑒定、共生菌、病原菌的微生物遺傳多樣性的檢測等。后來有人利用ardra方法考察兩種不同農田土壤的微生物群落時，發(fā)現(xiàn)兩者無顯著差異。張于光等利用rflp方法對三江源地區(qū)不同的植物類型的土壤中固氮微生物群組成進行了研究，發(fā)現(xiàn)所有土壤樣品中分別具有1-2個優(yōu)勢微生物種群。但是該技術所能獲得的信息量相對較少，并且難以用來評估物種的豐度和均度。五、末端限制性片段長度多態(tài)性（t-rflp ）t-rflp是rflp/ardra方法的進一步發(fā)展，所不同的是在pcr擴增16s rrna基因過程中，其中一個引物用熒光標記，在計算機程序自動分析時僅分析熒光標記的末端限制片段，這樣使得限制片段長度多態(tài)性圖譜更為簡化，并且每個可見的條帶都代表一個“核型”或一個分類單元。此法能夠得到一個群落的特征指紋圖譜，可用于比較不同群落的相似性和由于污染造成的群落結構在時間和空間上的改變。pett等利用t-rflp技術考察氧化還原電位對土壤菌群的影響，研究發(fā)現(xiàn)經過4 d的好氧/厭氧處理與未處理的土壤樣品菌群結構相似，而經過持續(xù)12 h的厭氧或好氧處理的土壤樣品得到的分子條帶則明顯不同，在所有樣品的179種條帶圖譜中只有3種是普遍存在的，同時還發(fā)現(xiàn)土著菌群對氧化還原電位的變化具有耐受性。c