SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS Polyacrylamidegelelectrophoresis SDS PAGE 一 什么是SDS 十二烷基硫酸鈉 sodiumdodecylsulfate SDS 是一種陰離子去污劑 它在水溶液中以單體 monomer 和分子團(tuán) micellae 的混合形式存在 SDS的作用 破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵 使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象 保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 二 SDS PAGE的基本原理 一 蛋白質(zhì)分子的解聚樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后 蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小 而電荷因素可以被忽略 1 SDS陰離子去污劑變性劑助溶性試劑斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵分子去折疊破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 2 強(qiáng)還原劑巰基乙醇 mercaptoethanal 二硫蘇糖醇 dithiothreitol DTT 使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂 SDS和還原劑的作用 1 分子被解聚或組成它們的多肽鍵 2 氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) SDS膠束 3 蛋白質(zhì) SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量 消除了不同分子之間原有的電荷差異 蛋白質(zhì) SDS膠束的特點(diǎn) 1 形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒 2 短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基 SDS膠束基本上是相同的 3 長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比 膠束在SDS PAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響 而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度 即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD 200KD之間時(shí) 電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 3 影響SDS電泳的關(guān)鍵因素 1 溶液中SDS單體濃度 1mmol L 大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1 1 4 2 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度 不 0 26 低離子強(qiáng)度的溶液中 SDS單體才具有較高的平衡濃度 3 二硫鍵是否完全被還原當(dāng)二硫鍵被徹底還原后 蛋白質(zhì)分子才能被解聚 SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系 二 緩沖系統(tǒng)的選擇一般情況下 在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍 凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用 但緩沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的 電泳緩沖液的種類 1 磷酸緩沖液2 Tris 醋酸鈉緩沖系統(tǒng)3 咪唑緩沖液系統(tǒng) 比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低 電泳速度要比后者快一倍 4 尿素系統(tǒng) 適用分子量低于15KD的蛋白樣品 5 Tris 甘氨酸系統(tǒng) 使用最多的緩沖液6 Tris 硼酸鹽緩沖液 測(cè)定糖蛋白的分子量 三 凝膠濃度的選擇由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度 只取決于分子解聚后SDS 蛋白質(zhì)膠束的大小 因此凝膠濃度的選擇會(huì)直接影響分辨率 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度 四 分子量測(cè)定1 相對(duì)遷移率 Rf Rf即用每個(gè)帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的 測(cè)量位置應(yīng)在蛋白帶的中央 蛋白帶遷移距離Rf 溴酚藍(lán)遷移距離 蛋白帶遷移距離固定前的凝膠長(zhǎng)度Rf X 干燥后的凝膠長(zhǎng)度溴酚藍(lán)遷移距離 2 作圖以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo) Rf為橫坐標(biāo)繪圖 3 通過(guò)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的Rf值 便可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量 三 去污劑的選擇無(wú)離子去污劑 LubroW Brij35 TweenTriton陽(yáng)離子去污劑 cetyltrimethylammoniumbromide CTAB cetylpyyridinium CPC 陰離子去污劑 SDSdeoxycholate 四 方法1 分類 1 根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同還原SDS電泳非還原SDS電泳帶有烷基化作用的還原SDS電泳 2 根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同連續(xù)電泳不連續(xù)電泳 3 根據(jù)電泳的形式圓盤電泳垂直電泳平板電泳水平電泳 2 操作 1 制備分離膠 2 制備積層膠 堆積膠 分離膠聚合之后 3 加樣品樣品的處理在蛋白溶液中加入過(guò)量的SDS后 可引起以下的反應(yīng) 蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽氫鍵斷裂疏水相互作用被取消多肽被去折疊 二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞 并形成橢球形 還原SDS處理當(dāng)加入還原試劑DTT或 二巰基乙醇后 蛋白質(zhì)被完全去折疊 只根據(jù)分子量分離 帶有烷基化作用的還原SDS處理烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護(hù)SH基團(tuán) 而得到窄的電泳帶 非還原的SDS處理許多樣品 如生理體液 血清或尿素 一般只需用1 SDS在100 煮沸3分鐘 并不需要加還原劑 此時(shí)二硫鍵不能被斷裂 蛋白并沒(méi)有完全被去折疊 4 電泳 5 固定 6 染色考馬斯亮藍(lán) coomassiebrilliantblue R 250三苯基甲烷 紅藍(lán)色 每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3H基團(tuán) 偏酸性 和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上 G 250二甲花青亮藍(lán) 藍(lán)綠色 銀染色銀染的機(jī)制是將蛋白帶上的硝酸銀 銀離子 還原成金屬銀 以使銀顆粒沉積在蛋白帶上 7 照相 凝膠干燥 8 定量測(cè)定 3 電泳過(guò)程中的不正?，F(xiàn)象 1 微笑 現(xiàn)象指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形 說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻 中間部分冷卻不好 2 皺眉 現(xiàn)象由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的 特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的 三明治 底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全 3 拖尾 現(xiàn)象樣品溶解不佳引起 4 紋理 現(xiàn)象由于樣品中的不溶顆粒引起的 5 偏斜現(xiàn)象電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起 6 帶太寬加樣量太多或加樣孔泄漏引起 MolecularmassversusmolecularweightMolecularmass symbolm isexpressedinDaltons Da OneDaltonisdefinedas1 12themassofcarbon12 MostmacromoleculesarelargeenoughtousethekiloDalton kDa todescribemolecularmass Molecularweightisnotthesameasmolecularmass Itisalsoknownasrelativemolecularmass symbolMr whererisasubscript Molecularweightisdefinedastheratioofthemassofamacromoleculeto1 12themassofacarbon12atom Itisadimensionlessquantity WhentheliteraturegivesamassinDaorkDaitreferstomolecularmass Itisincorrecttoexpressmolecularweight relativemolecularmas