自來(lái)水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定姓名:樊婧婧指導(dǎo)教師：陳燕飛（太原師范學(xué)院生物系111班學(xué)號(hào)2011131139）摘 要 各種天然水中常常含一定數(shù)量的微生物。天然水中微生物的主要來(lái)源是：水中的水生性微生物（如光合藻類）、來(lái)自土壤徑流、降雨的外來(lái)菌群和來(lái)自下水道的污染物和人畜的排泄物等。自來(lái)水是指通過自來(lái)水處理廠凈化、消毒后生產(chǎn)出來(lái)的符合國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)的供人們生活、生產(chǎn)使用的水。它主要通過水廠的取水泵站汲取江河湖泊及地下水，地表水。并經(jīng)過沉淀、消毒、過濾等工藝流程，最后通過配水泵站輸送到各個(gè)用戶，但是自來(lái)水中仍然含有微量的微生物。我國(guó)飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中細(xì)菌總數(shù)（1mL水樣中所含的細(xì)菌菌落的總數(shù)）每毫升不超過100個(gè)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類繁多，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長(zhǎng)繁殖，因此，以某種培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，計(jì)算出來(lái)的水中細(xì)菌總數(shù)僅是近似值。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在保證無(wú)菌的環(huán)境下，采取自來(lái)水的樣品，利用培養(yǎng)基制作平板，按菌落計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得的菌落數(shù)對(duì)照國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷水質(zhì)。自來(lái)水的微生物學(xué)檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。關(guān)鍵字 平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 ；細(xì)菌總數(shù) 引 言 水是生命之源，人的生存離不開水環(huán)境，水質(zhì)的好壞對(duì)人們生活起著至關(guān)重要的作用，而判斷水質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，微生物在水中的數(shù)量、種類是必不可少的。良好的飲用水細(xì)菌總數(shù)應(yīng)500CFU/mL則不宜飲用，我國(guó)飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-85）規(guī)定每毫升水樣細(xì)菌總數(shù)37培養(yǎng)24h不得大于100個(gè)。細(xì)菌總數(shù)是指1mL水樣在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。本實(shí)驗(yàn)只包括一群能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫的需氧的細(xì)菌菌落總數(shù)。 水中細(xì)菌種類繁多，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長(zhǎng)繁殖，因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，計(jì)算出來(lái)的水中細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值。通過此方法我們能夠計(jì)算出水中的細(xì)菌總數(shù)，從而判斷自來(lái)水是否符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，是否受到污染。國(guó)際上一般都采用總大腸菌群作為指示菌，每升水中的總大腸菌群指數(shù)。我國(guó)飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-85）規(guī)定每升水中總大腸菌群37培養(yǎng)48h小于3個(gè)。每升飲用水的水源中，總大腸菌群不得超過1000個(gè)。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。除采用平板計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)外，現(xiàn)在已有許多種快速、簡(jiǎn)便的微生物檢測(cè)儀或試劑紙等也用來(lái)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。41材料與方法1.1 時(shí)間地點(diǎn)1.1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 2013年10月19日20日1.1.2 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn) 太原師范學(xué)院南區(qū)實(shí)驗(yàn)教學(xué)樓微生物實(shí)驗(yàn)室1.2 材料、試劑與儀器1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 自來(lái)水 1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 1mol/LNaOH 1mol/LHCl 蒸餾水 1.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器 高壓蒸氣滅菌鍋 培養(yǎng)皿 天平 pH試紙（pH5.5-9.0） 量筒 玻璃棒 電熱爐 牛角匙 移液管 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 滅菌(1)首先將內(nèi)鍋層取出,再向外鍋內(nèi)加入適量的水,使水面與三角擱架相平為宜。(2)放回內(nèi)鍋層,并把實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)皿、三角燒杯、移液管放入其中。(3)加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，使螺旋松緊一致，勿使漏氣。(4)用電爐加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力上升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用0.1MPa,121,20min滅菌。(5)滅菌時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時(shí)打開排氣閥，旋松螺旋，打開蓋子，取出滅菌物品。1.3.2 水樣的采取放開水龍頭使水流5min后，用已滅菌的三角燒瓶接取水樣，以待分析。1.3.3 制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1.3.3.1稱量按培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確的稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。1.3.3.2溶化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。1.3.3.3調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH，直至pH達(dá)7.6。反之，用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。1.3.4 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定1.3.4.1滅菌移液管管吸取1mL水樣，注入其中一套滅菌的培養(yǎng)皿中。共做四個(gè)平皿。1.3.4.2分別傾注約15mL已溶化并冷卻到45左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立即在桌上作平面旋搖，使自來(lái)水和培養(yǎng)基混勻。1.3.4.3另取一空的滅菌培養(yǎng)皿，傾注肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15mL，作空白對(duì)照。1.3.4.4待培養(yǎng)基凝固后，倒置于37溫箱中，培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。四個(gè)平板的平均菌落數(shù)即為1mL自來(lái)水的細(xì)菌總數(shù)。2結(jié)果與分析2.1 菌落照片 2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2.2.1 表 自來(lái)水中菌落數(shù)表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平板序號(hào)1234對(duì)照組菌落數(shù)目（個(gè)）5263685702.2.2 菌落記數(shù)方法 （1）先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)，若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)。（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30300之間的，則只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的菌落總數(shù)。（3）若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均30300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)；若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)。（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。 （5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。根據(jù)我國(guó)自來(lái)水的飲用標(biāo)準(zhǔn)，即自來(lái)水中的大腸桿菌數(shù)不超過100個(gè)/mL，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果是60個(gè)/mL，故可知實(shí)驗(yàn)所取自來(lái)水樣達(dá)標(biāo)。3討論人的生存離不開水環(huán)境，水質(zhì)的好壞對(duì)人們生活起著至關(guān)重要的作用，而判斷水質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，微生物在水中的數(shù)量、種類是必不可少的。細(xì)菌是微生物界的一個(gè)大類群，它與人類的生活密切相關(guān)，其中有的有益，有的有害，為了我們更好的生活，我們必須研究細(xì)菌，并掌握一些方法，來(lái)使細(xì)菌向人類有用的方面發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用平板菌落技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。采用能使大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，采集自來(lái)水的樣品，利用培養(yǎng)基制作平板，在適宜無(wú)菌條件下培養(yǎng)自來(lái)水中的細(xì)菌，按菌落計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得的菌數(shù)對(duì)照國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷水質(zhì)。所以實(shí)驗(yàn)過程中保證無(wú)雜菌污染和適宜環(huán)境培養(yǎng)自來(lái)水中細(xì)菌尤為重要。實(shí)驗(yàn)過程中的一些注意事項(xiàng)：（1） 高壓蒸汽滅菌鍋使用時(shí)，切勿忘記加水，同時(shí)加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故；（2） 滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。壓力一定要降到0時(shí)，才能打開排氣閥，開蓋取物。（3） 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基的熔化時(shí)因不斷攪拌，以免瓊脂糊底燒焦，沸騰后繼續(xù)加熱35分鐘。（4） 倒置培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)降溫至45 ，溫度過高會(huì)燙死大腸桿菌，過低會(huì)使培養(yǎng)基凝固。（5） 傾注培養(yǎng)基后要將平皿在桌面上做勻速旋轉(zhuǎn)，將培養(yǎng)基和自來(lái)水樣搖勻，在培養(yǎng)基中觀察時(shí)可見一些菌苔就是平皿沒有搖勻的結(jié)果。（6） 培養(yǎng)基不能反復(fù)升降溫，傾入培養(yǎng)皿后應(yīng)立即加蓋，且滅菌后不應(yīng)在空氣中放置，以免雜菌混入。（7） 應(yīng)在高溫時(shí)在對(duì)照組中倒入培養(yǎng)基，否則對(duì)照組中會(huì)出現(xiàn)大量的菌落。 實(shí)驗(yàn)過程中的誤差分析：（1） 傾注培養(yǎng)基后平皿在桌面上做勻速旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基和自來(lái)水樣搖勻，但由于平皿沒有搖勻在培養(yǎng)基中可見一些菌苔。（2） 由于菌種在固體培養(yǎng)基上借助重力作用而形成的，所以觀察到絕大多數(shù)的細(xì)菌著生在培養(yǎng)基表面。4結(jié)論本實(shí)驗(yàn)的成敗在于滅菌、無(wú)菌操作技術(shù)、培養(yǎng)基的溫度等方面是否操作正確，因此接種過程務(wù)必防止雜菌的侵入。根據(jù)我國(guó)自來(lái)水的飲用標(biāo)準(zhǔn)，即自來(lái)水中的大腸桿菌數(shù)不超過100個(gè)/mL，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果是60個(gè)/mL可知實(shí)驗(yàn)所取的自來(lái)水樣達(dá)標(biāo)。 該實(shí)驗(yàn)存在著如下一些不準(zhǔn)確的因素會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1）在數(shù)菌落時(shí)，菌落太小且又處于培養(yǎng)基內(nèi)部這樣就不能觀察到菌落從而影響結(jié)果；（2）在培養(yǎng)過程中由于細(xì)菌之間的相互抑制也會(huì)使計(jì)數(shù)菌落減少。因此，只有在實(shí)驗(yàn)不需要精確的情況下才可使用此方法。雖然水中存在大量的細(xì)菌且種類繁多，但由于牛肉膏蛋白胨所提供的生長(zhǎng)條件的限制，培養(yǎng)基中所得的細(xì)菌群落較單一為大腸桿菌，呈圓片狀。（3）對(duì)照組中的菌落數(shù)為0個(gè)，說明我們實(shí)驗(yàn)做得很成功。如果對(duì)照組中的菌落數(shù)不為0個(gè)，這主要是因?yàn)橛须s菌混入，雜菌來(lái)源可能：培養(yǎng)皿、三角燒杯、吸管等儀器滅菌不充分；滅菌后在空氣中放置又落入雜菌；無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)，培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿后沒有立即加蓋；配置培養(yǎng)基時(shí)反復(fù)升降溫，使一些雜菌產(chǎn)生抗性等。參考文獻(xiàn)1陳聲明，劉麗麗. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法 北京：人民教育出版社，19822沈萍，陳向東. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)M.4版.北京：高等教育出版社，20073李根生 干燥培養(yǎng)基恩德制造及應(yīng)用 上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，19944郝士海 現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)手冊(cè) 北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，19925羅雪云等 食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè) 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，19956