2020 2 18 1 第三章 熒光分析法 2020 2 18 2 目錄 3 1概述 3 2熒光分析基本原理 3 3熒光分析儀器 3 4熒光分析方法及應(yīng)用 2020 2 18 3 3 1概述 分子發(fā)光某些物質(zhì)的分子吸收一定能量躍遷到較高的電子激發(fā)態(tài)后 在返回電子基態(tài)的過程中伴隨有光輻射的現(xiàn)象 光致發(fā)光物質(zhì)因吸收光能而激發(fā)發(fā)光的現(xiàn)象 熒光當(dāng)紫外光照射到某些物質(zhì)的時候 這些物質(zhì)會發(fā)射出各種顏色和不同強度的可見光 而當(dāng)紫外線停止照射時 所發(fā)射的光線也隨之很快地消失 這種光線 熒光 2020 2 18 4 發(fā)展史理論 第一次記錄熒光現(xiàn)象 1575年 西班牙內(nèi)科醫(yī)生 植物學(xué)家莫納德斯 N Monardes 提到 一種木頭切片的水溶液呈 可愛的天藍色 17世紀 波義爾 Boyle 和牛頓 Newton 等再次觀察到熒光現(xiàn)象并給予了更詳細的描述 1852年 斯托克斯 G G Stokes 用分光光度計考察奎寧和葉綠素時發(fā)現(xiàn) 吸 熒 斯托克斯定則 所以判斷熒光是先吸光再發(fā)光 即熒光是發(fā)射光 并且根據(jù)發(fā)熒光的礦物 螢石 熒光 此外他還研究了熒光強度與濃度之間的關(guān)系 描述了高濃度時及有外來物質(zhì)存在時的熒光猝滅現(xiàn)象 他也是第一個提出應(yīng)用熒光作分析手段的人 2020 2 18 5 1867年 瑞士 高貝爾斯萊德 F Goppelsr der 進行了首次的熒光分析工作 應(yīng)用鋁 桑色素配合物的熒光進行鋁的測定 1880年 萊伯曼 Liebeman 提出了最早關(guān)于熒光與化學(xué)結(jié)構(gòu)關(guān)系的經(jīng)驗法則 19世紀末 人們已經(jīng)知道了600種以上的熒光化合物 20世紀以來 熒光現(xiàn)象的研究就更多了 1905年 伍德 Wood 發(fā)現(xiàn)共振熒光 1914年 弗蘭克 Frank 和赫茲 Hertz 利用電子沖擊發(fā)光進行定量研究 1922年 Wawillous進行熒光產(chǎn)率的絕對測定 1926年 蓋維奧拉 Gaviola 進行了熒光壽命的直接測定 2020 2 18 6 儀器 19世紀前 熒光觀察靠肉眼 1928年 哲蒂 Jette 和維斯特 West 研制出第一臺光電熒光計 如今 已有各式各樣新型的熒光分析儀問世 熒光分析已成為一種十分重要且有效的光譜分析手段 2020 2 18 7 3 2熒光分析基本原理 一 熒光和磷光的產(chǎn)生發(fā)光室溫下 大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動能層 處于基態(tài)的分子吸收能量 電能 熱能 化學(xué)能或光能等 后被激發(fā) 躍遷到激發(fā)態(tài) 激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定 分子將很快衰變到基態(tài) 若返回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射 這種現(xiàn)象稱為 發(fā)光 2020 2 18 8 原理 1 分子能級每個分子具有一系列嚴格分立的能級 稱為電子能級 而每個電子能級中又包含一系列的振動能層和轉(zhuǎn)動能層 So 基態(tài)S1 第一電子激發(fā)單重態(tài)S2 第二電子激發(fā)單重態(tài)T1 第一電子激發(fā)三重態(tài)T2 第二電子激發(fā)三重態(tài) 0 1 2 3 振動能層 圖3 1熒光和磷光體系能級圖 2020 2 18 9 2 電子激發(fā)多重度Ms 電子自旋量子數(shù)代數(shù)和 數(shù)值為0或1 單重態(tài)分子軌道中的電子都是自旋配對的 自旋方向相反 s 0 M 1用符號S表示三重態(tài)電子躍遷過程中伴有自旋方向的改變s 1 M 3用符號T表示 2020 2 18 10 3 分子去活化處在激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的 它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過程返回基態(tài) 其中以速度最快 激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢 有以下幾種基本的去活化過程 振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換熒光發(fā)射系間跨越磷光發(fā)射外轉(zhuǎn)換 2020 2 18 11 振動馳豫當(dāng)分子吸收光輻射后可能從基態(tài)的最低振動能層S0 0 躍遷到激發(fā)態(tài)Sn i 的較高的振動能層上去 然而在液相或壓力足夠高的氣相中 分子間碰撞的幾率很大 激發(fā)態(tài)分子可能將過剩的振動能量以熱的形式傳遞給周圍的分子 而自身從Sn或Tn的高振動能層 i 失活到該電子能級的最低振動能層 0 上 這一過程稱為振動弛豫 振動松弛 時間10 12sSn或Tn的 i 0 即各振動能級間的小箭頭 2020 2 18 12 圖3 1熒光和磷光體系能級圖 2020 2 18 13 內(nèi)轉(zhuǎn)換相同多重度等能態(tài)間的一種無輻射躍遷過程稱為內(nèi)轉(zhuǎn)換 當(dāng)兩個相同多重度電子能級的振動能層間有重疊時 則可能發(fā)生電子由高能層電子激發(fā)態(tài)以無輻射躍遷方式躍遷到低能層的電子激發(fā)態(tài) 如由S2 S1 T2 T1 時間10 13 10 11s分子最初無論在哪一個激發(fā)單重態(tài) 都能通過振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換到達最低激發(fā)單重態(tài) 或三重態(tài) 的最低振動能層上 2020 2 18 14 圖3 1熒光和磷光體系能級圖 2020 2 18 15 熒光發(fā)射當(dāng)分子處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級S1 0 時 發(fā)射一個光子返回基態(tài)S0 i 這一過程稱為熒光發(fā)射 由于溶液中振動弛豫效率很高 它在熒光發(fā)射之前和發(fā)射之后都可能發(fā)生 因此發(fā)射熒光的能量比分子所吸收的能量要小 即熒光的特征波長比它所吸收的特征波長要長 時間10 9 10 7s熒光多為S1 S0躍遷 2020 2 18 16 圖3 1熒光和磷光體系能級圖 2020 2 18 17 系間跨越不同多重度狀態(tài)間的一種無輻射躍遷過程稱為系間跨越 它涉及受激電子自旋狀態(tài)的改變 如S1 T1 使原來兩個自旋配對的電子不再配對 這種躍遷一般是禁阻的 但如果兩個不同多重度電子能態(tài)的振動能層有較大的重疊時則可能通過自旋 軌道耦合等作用使其實現(xiàn) 2020 2 18 18 圖3 1熒光和磷光體系能級圖 2020 2 18 19 磷光發(fā)射當(dāng)從單重態(tài)到三重態(tài)的分子系間跨越躍遷發(fā)生后 接著發(fā)生快速的振動弛豫而到達三重態(tài)的最低振動能層上 當(dāng)沒有其他過程同它競爭時 分子將發(fā)生磷光躍遷回基態(tài) 這一過程稱為磷光發(fā)射 熒光與磷光的根本區(qū)別是 熒光 由激發(fā)單重態(tài)最低振動能層至基態(tài)各振動能層的躍遷產(chǎn)生 磷光 由激發(fā)三重態(tài)最低振動能層至基態(tài)各振動能層的躍遷產(chǎn)生的 E熒 E磷 熒 磷時間10 4 10s 2020 2 18 20 圖3 1熒光和磷光體系能級圖 2020 2 18 21 外轉(zhuǎn)換激發(fā)分子通過與溶劑或其他溶質(zhì)分子間的相互作用和能量轉(zhuǎn)換 使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程稱外轉(zhuǎn)換 這一現(xiàn)象稱為 熄滅 或 猝滅 由較低的激發(fā)單重態(tài)及較低的三重態(tài)的非輻射躍遷可包含外轉(zhuǎn)換 也可包含內(nèi)轉(zhuǎn)換 2020 2 18 22 圖3 1熒光和磷光體系能級圖 2020 2 18 23 二 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何熒光 磷光 化合物都具有兩個特征光譜 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 它們是熒光 磷光 定性和定量分析的基本參數(shù)和依據(jù) 激發(fā)光譜選擇 熒光和磷光都是光致發(fā)光 因此必須選擇合適的激發(fā)光波長 這可從它們的激發(fā)光譜曲線來確定 繪制 固定測量波長 選熒光 磷光的最大發(fā)射波長 改變激發(fā)光的波長 測量熒光強度的變化 以激發(fā)光波長為橫坐標 熒光強度為縱坐標作圖 即得到熒光 磷光 化合物的激發(fā)光譜 2020 2 18 24 激發(fā)光譜的形狀與吸收光譜的形狀極為相似 經(jīng)校正后的真實激發(fā)光譜與吸收光譜不僅形狀相同 而且波長位置也一樣 這是因為物質(zhì)分子吸收能量的過程就是激發(fā)過程 發(fā)射光譜 熒 磷 光光譜繪制 將激發(fā)光波長固定在最大激發(fā)波長處 然后掃描發(fā)射波長 測定不同發(fā)射波長處的熒 磷 光強度 即得到熒 磷 光發(fā)射光譜 例 圖3 2為萘的激發(fā)光譜 熒光發(fā)射光譜和磷光發(fā)射光譜 熒光發(fā)射光譜顯示了若干普遍的特性 2020 2 18 25 Stokes位移在溶液中 分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長 稱為Stokes位移 這是由于受激分子通過振動弛豫而失去振動能 也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞 也會有能量的損失 因此在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失 圖3 2萘的激發(fā)光譜I 熒光II和磷光光譜III 激發(fā) 吸收光譜 磷光光譜 熒光光譜 2020 2 18 26 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 這是因為分子吸收了不同能量的光子可以由基態(tài)激發(fā)到幾個不同的電子激發(fā)態(tài) 而具有幾個吸收帶 由于較高激發(fā)態(tài)通過內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動弛豫回到第一電子激發(fā)態(tài)的速率是很高的 遠大于由高能激發(fā)態(tài)直接發(fā)射光子的速率 故在熒光發(fā)射時 不論用哪一個波長的光激發(fā) 電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層返回到基態(tài)的各個振動能層 所以熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長無關(guān) 2020 2 18 27 鏡像規(guī)則熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關(guān)系 吸收光譜是物質(zhì)分子由基態(tài)激發(fā)至第一電子激發(fā)態(tài)的各振動能層所致 其形狀決定于第一電子激發(fā)態(tài)中各振動能層的分布情況 熒光光譜是激發(fā)分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層回到基態(tài)中各不同能層所致 所以熒光光譜的形狀決定于基態(tài)中各振動能層的分布情況 基態(tài)中振動能層的分布和第一電子激發(fā)態(tài)中振動能層的分布的情況是類似的 因此熒光光譜的形狀和吸收光譜極為相似 2020 2 18 28 圖3 3蒽的乙醇溶液的熒光光譜 右 和吸收光譜 左 2020 2 18 29 三 熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件 i 分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu) 才能吸收激發(fā)光 ii 吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后 必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率 思考 什么樣結(jié)構(gòu)的物質(zhì)會發(fā)生熒光 化學(xué)結(jié)構(gòu)上的改變對物質(zhì)熒光強度和熒光光譜有什么樣的影響 2020 2 18 30 熒光量子產(chǎn)率 它表示物質(zhì)發(fā)熒光的能力 許多吸光物質(zhì)并不能發(fā)熒光 因為在激發(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能的過程中除熒光發(fā)射外 還有許多上面提到的輻射和非輻射的躍遷過程與之競爭 熒光的量子產(chǎn)率與上述的每個過程的速率常數(shù)有關(guān) 表達式如下 熒光發(fā)射過程的速率常數(shù) 其他有關(guān)的過程速率常數(shù)總和 凡是可以使升高 降低的因素都可以增強熒光主要決定于化學(xué)結(jié)構(gòu) 主要決定于化學(xué)環(huán)境 也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān) 2020 2 18 31 躍遷類型實驗表明 大多數(shù)熒光化合物都是由 或 躍遷激發(fā) 然后經(jīng)過振動弛豫或其他無輻射躍遷 再發(fā)生 或 躍遷而產(chǎn)生熒光 其中 的躍遷的量子效率較高 此外 在 躍遷過程中 通過系間跨越躍遷至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小 也有利于熒光的發(fā)射 共軛效應(yīng)含有 躍遷能級的芳香族化合物的熒光最強 這種體系中的 電子共軛度越大 則 電子非定域性越大 越易被激發(fā) 熒光也就越易發(fā)生 而且熒光光譜將隨共軛程度的增加向長波移動 2020 2 18 32 絕大多數(shù)能發(fā)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán) 任何有利于提高 電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變都將提高熒光效率 并使熒光波長向長波方向移動 剛性平面結(jié)構(gòu)實驗發(fā)現(xiàn)多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機分子具有強烈的熒光 因為這種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動 使分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用減小 減少了碰撞去活的可能性 酚酞 熒光素 無熒光 強熒光 氧橋 2020 2 18 33 取代基效應(yīng)芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對該化合的熒光強度和熒光光譜有很大的影響 給電子基團 如 0H OR NH2 CN NR2等 使熒光增強 吸電子基團 如 COOH C O NO2 NO 鹵素離子等 會減弱甚至猝滅熒光 如果將一個高原子序數(shù)的原子引入到 電子體系中 往往會增強磷光而減弱熒光 重原子效應(yīng) 增加系間跨越速率所致 2020 2 18 34 如 鹵代苯中雙取代和多取代物對非定域 電子激發(fā)的影響較難預(yù)測 但若能增加分子的平面性 例如取代基之間能形成氫鍵 則熒光增強 反之 則熒光減弱 溴苯 無熒光 氟苯 氯苯 碘苯 2020 2 18 35 四 溶液的熒 磷 光強度熒光強度與溶液濃度的關(guān)系熒光量子產(chǎn)率熒光強度If與溶液濃度c的關(guān)系 根據(jù)Beer定律 經(jīng)推導(dǎo)可得 當(dāng)I0和一定時 吸收的光量 線性關(guān)系成立條件 2020 2 18 36 影響熒光強度的因素溶劑 溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng) 溶劑效應(yīng) 溶劑的折射率和介電常數(shù)的影響 普遍存在 溶劑對光的散射和折射 溶劑極性增大 對激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定作用增強 使熒光強度增加 光譜紅移 特殊溶劑效應(yīng) 熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用 如氫鍵的生成和化合作用 對熒光光譜的強度和形狀影響大 溫度 敏感 影響大 下降 碰撞失活幾率減小 有利于熒光產(chǎn)生 分析時要控制好溫度 2020 2 18 37 溶液pH值 帶有酸性或堿性官能團的大多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液的pH有關(guān) 影響分子的存在形式 如 苯胺 pH7 12 分子形式 藍色熒光pH13 離子形式 無熒光金屬離子與有機試劑形成的發(fā)光螯合物也受到溶液pH的影響 影響螯合物的形成和組成 如 鎵與2 2 二羥基偶氮苯的螯合物 pH3 4 1 1螯合物 有熒光pH6 7 1 2螯合物 無熒光 2020 2 18 38 內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象 內(nèi)濾光作用 溶液中若存在著能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì) 就會使熒光減弱 這種現(xiàn)象稱為內(nèi)濾光作用 如 1 g cm 3的色氨酸溶液中 如有K2Cr2O7存在 由于色氨酸的激發(fā)和發(fā)射峰附近正好是K2Cr2O7的兩個吸收峰 K2Cr2O7吸收了色氨酸的激發(fā)能和發(fā)射的熒光 使測得的色氨酸熒光大大減弱 自吸收現(xiàn)象 內(nèi)濾光作用的另一種情況是熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的短波長一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長波長一端有重疊 在溶液濃度較大時一部分熒光發(fā)射被自身吸收 這種現(xiàn)象稱為自吸收 2020 2 18 39 溶液的熒光猝滅熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅 能引起熒光強度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑 猝滅形式 碰撞猝滅靜態(tài)猝滅 組成化合物的猝滅 轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅熒光物質(zhì)的自猝滅 2020 2 18 40 3 3熒光分析儀 結(jié)構(gòu) 圖3 4熒光分析儀基本部件示意圖 2020 2 18 41 由光源發(fā)出的光經(jīng)第一單色器得到所需要的激發(fā)光波長 激發(fā)光通過樣品池后 由于一部分光能被熒光物質(zhì)吸收 其透射光強度將減弱 熒光物質(zhì)被激發(fā)后 將發(fā)射熒光 為了消除入射光 透射光 和散射光的影響 熒光的測量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進行 為消除可能共存的其他光線的干擾 如由激發(fā)光所產(chǎn)生的反射光 Rayleight 瑞利 散射光和Raman 拉曼 光 以及為將溶液中雜質(zhì)所發(fā)生的熒光濾去 以獲得所需要的熒光 在樣品池和檢測器之間設(shè)置了第二單色器 得到的熒光作用于檢測器上 得到相應(yīng)的電信號 經(jīng)放大后再記錄下來 2020 2 18 42 組成激發(fā)光源 在紫外 可見區(qū)范圍 常用的光源是氙燈和高壓汞燈 樣品池 熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成 通常用石英 形狀以方形和長方形為宜 單色器 較精密的熒光分光光度計均采用光柵 有兩個 第一單色器用于選擇激發(fā)波長 第二單色器用于分離出熒光發(fā)射波長 檢測器 熒光的強度通常比較弱 因此要求檢測器具有較高的靈敏度 一般由光電管或光電倍增管作檢測器 并與激發(fā)光成直角 2020 2 18 43 3 4熒光分析方法及應(yīng)用 熒光分析方法的特點靈敏度高與紫外 可見分光光度法比較 熒光是從入射光的直角方向檢測 即 在黑背景下檢測熒光的發(fā)射 所以靈敏度要比紫外 可見分光光度法高2 4個數(shù)量級 它的測定下限在0 1 0 001 g cm 3之間 2020 2 18 44 實際工作中用相對靈敏度表示 i 以喹寧在0 05mol dm 3H2SO4溶液中的熒光強度為標準 定為1 然后與相同濃度熒光物質(zhì)的熒光強度進行比較 即可求得該物質(zhì)的相對靈敏度 ii 水的拉曼光信噪比表示 選擇性強熒光法既能依據(jù)特征發(fā)射 又能依據(jù)特征吸收來鑒定物質(zhì) 假如某幾個物質(zhì)的發(fā)射光譜相似 可以從激發(fā)光譜的差異把它們區(qū)分開來 而如果它們的吸收光譜相同 則可用發(fā)射光譜將其區(qū)分 2020 2 18 45 試樣量少和方法簡便提供比較多的物理參數(shù)提供 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以及熒光強度 熒光效率 熒光壽命等許多物理參數(shù) 這些參數(shù)反映了分子的各種特性 能從不同角度提供被研究分子的信息 熒光分析方法的弱點應(yīng)用范圍不夠廣 因為本身能發(fā)熒光的物質(zhì)相對較少 用加入某種試劑的方法將非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)來進行分析 其數(shù)量也不是很多 干擾因素多 測定時需要嚴格控制條件 2020 2 18 46 定量測定方法校準曲線法用已知量的標準物質(zhì)經(jīng)過和試樣一樣的處理后 配成一系列標淮溶液 在一定的儀器