www.CRTER.org熊樂(lè)，等. TOLL樣受體4拮抗劑干預(yù)周?chē)窠?jīng)損傷后的瓦勒變性TOLL樣受體4拮抗劑干預(yù)周?chē)窠?jīng)損傷后的瓦勒變性熊 樂(lè)1，張 蓓1，沈若武2，季愛(ài)玉3，孫廣強(qiáng)1，邊洪琳3，張鳳玉1，王 毅1，黃 恒4，李華僑1，周善宇5，沈兆康6，王 忠1(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，1免疫學(xué)教研室，2解剖教研室，山東省青島市 266071；3青島大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科，山東省青島市 266003；4解放軍第401醫(yī)院手外科，山東省青島市 266072；5青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院整形外科，山東省青島市 266071；6青島市第五十八中學(xué)，山東省青島市 266100)引用本文：熊樂(lè)，張蓓，沈若武，季愛(ài)玉，孫廣強(qiáng)，邊洪琳，張鳳玉，王毅，黃恒，李華僑，周善宇，沈兆康，王忠. TOLL樣受體4拮抗劑干預(yù)周?chē)窠?jīng)損傷后的瓦勒變性J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(42):6308-6316.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.012 ORCID: 0000-0003-2714-3637(熊樂(lè))文章快速閱讀：特異性拮抗Toll樣受體4對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷早期瓦勒變性及軸突再生的影響熊樂(lè)，女，1991年生，湖北省襄陽(yáng)市人，漢族，青島大學(xué)在讀碩士，主要從事神經(jīng)免疫方面的研究。 通訊作者：張蓓，博士，副教授，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，山東省青島市 266071中圖分類(lèi)號(hào):R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):2095-4344(2016)42-06308-09稿件接受：2016-08-17僅暴露坐骨神經(jīng)建立坐骨神經(jīng)離斷模型建立坐骨神經(jīng)離斷模型 + TAK-242處理假手術(shù)組模型組處理組50只Wistar大鼠分別在術(shù)后24 h、 3 d、4 d和7 d按各檢測(cè)要求進(jìn)行取材檢測(cè)坐骨神經(jīng)中白細(xì)胞介素1 mRNA、單核細(xì)胞趨化蛋白1mRNA表達(dá)； 檢測(cè)坐骨神經(jīng)中CD68+巨噬細(xì)胞和iba1+許旺細(xì)胞的表達(dá)；觀察坐骨神經(jīng)髓鞘變化；觀察坐骨神經(jīng)的病理變化；檢測(cè)坐骨神經(jīng)中生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43蛋白的表達(dá)；檢測(cè)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。結(jié)論：Toll樣受體4信號(hào)通路參與周?chē)窠?jīng)損傷后的瓦勒變性。文題釋義：TOLL樣受體4(TLR4)：人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)TOLL樣受體相關(guān)蛋白，由TOLL樣受體4基因編碼的一種蛋白質(zhì)，參與激活固有免疫。它可以識(shí)別許多革蘭陰性細(xì)菌的脂多糖(LPS)，也可以選擇性識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌，它的配體也包括一些病毒蛋白、多糖及多種內(nèi)源性蛋白質(zhì)(如低密度脂蛋白，熱休克蛋白等)。瓦勒變性：即由于各種創(chuàng)傷、牽拉、缺血、高低溫、電擊等原因，直接使神經(jīng)纖維受損中斷，周?chē)窠?jīng)損傷后遠(yuǎn)段發(fā)生的軸突壞死、髓鞘分解消失和神經(jīng)鞘膜增生等一系列蛻變和細(xì)胞吞噬過(guò)程。摘要背景：外周神經(jīng)損傷后發(fā)生瓦勒變性，其機(jī)制復(fù)雜，從免疫學(xué)角度對(duì)其進(jìn)行調(diào)控可以影響神經(jīng)早期修復(fù)效果。目的：分析特異性拮抗Toll樣受體4(TLR4)對(duì)于大鼠坐骨神經(jīng)損傷早期瓦勒變性及軸突再生的影響。方法：將50只Wistar大鼠隨機(jī)分成3組：處理組及模型組橫斷大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)后，行神經(jīng)外膜端端吻合；假手術(shù)組僅游離出坐骨神經(jīng)，然后關(guān)閉切口。術(shù)前1 h及術(shù)后7 d處理組大鼠每天尾靜脈注射0.15 mg/kg Toll樣受體4拮抗劑TAK-242，模型組及假手術(shù)組大鼠尾靜脈注射同等體積生理鹽水。于術(shù)后24 h、3 d、4 d和7d取術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)。結(jié)果與結(jié)論：實(shí)時(shí)定量PCR顯示，與假手術(shù)組相比，術(shù)后24 h模型組白細(xì)胞介素1 mRNA和單核細(xì)胞趨化蛋白1 mRNA的表達(dá)均明顯升高(P 0.001，P 0.001)，與模型組相比，術(shù)后24 h處理組白細(xì)胞介素1 mRNA和單核細(xì)胞趨化蛋白1 mRNA的表達(dá)明顯降低(P 0. 001，P 0. 001)；免疫熒光可見(jiàn)，與模型組相比，術(shù)后3 d處理組中CD68+細(xì)胞和iba1+細(xì)胞表達(dá)均顯著下調(diào)(P 0. 01，P 0.05)；固蘭染色可見(jiàn)，在術(shù)后7 d，模型組和處理組坐骨神經(jīng)斷端均出現(xiàn)脫髓鞘反應(yīng)，但與模型組相比，處理組神經(jīng)斷端髓鞘碎片清除率明顯降低(P 0.05)；蘇木精-伊紅染色可見(jiàn)，在術(shù)后7 d，模型組坐骨神經(jīng)斷端較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，許旺細(xì)胞增殖活躍，神經(jīng)纖維大量再生通過(guò)吻合口，斷端修復(fù)正常，處理組神經(jīng)斷端炎性細(xì)胞較少，纖維組織增生較少，吻合口有縫隙，斷端修復(fù)能力減弱；免疫組織化學(xué)可見(jiàn)，與模型組相比，術(shù)后4 d處理組中生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P 0.05)；坐骨神經(jīng)功能指數(shù)顯示，與模型組相比，處理組大鼠在術(shù)后20，30和40 d同期比較明顯降低，差異有顯著性意義(P 0.05)。結(jié)果證實(shí)，Toll樣受體4拮抗劑導(dǎo)致大鼠坐骨周?chē)窠?jīng)損傷早期再生延遲，其機(jī)6309 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 制可能是抑制了瓦勒變性過(guò)程中的的Toll樣受體4信號(hào)通路。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；組織工程；周?chē)窠?jīng)；瓦勒變性；TAK-242；Toll樣受體4；巨噬細(xì)胞；許旺細(xì)胞；神經(jīng)再生主題詞：周?chē)窠?jīng)；Toll樣受體4；髓鞘；組織工程基金資助：山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃(J14LK10)Toll-like receptor 4 antagonist protects against Wallerian degeneration after peripheral nerve injuryXiong Le1, Zhang Bei1, Shen Ruo-wu2, Ji Ai-yu3, Sun Guang-qiang1, Bian Hong-lin3, Zhang Feng-yu1, Wang Yi1, Huang Heng4, Li Hua-qiao1, Zhou Shan-yu5, Shen Zhao-kang6, Wang Zhong1 (1Department of Immunology, 2Department of Anatomy, 5Department of Plastic Surgery, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, China; 3Department of Traumatic Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 4Department of Hand Surgery, the 401st Hospital of Chinese PLA, Qingdao 266072, Shandong Province, China; 6No. 58 High School of Qingdao, Qingdao 266100, Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: The mechanism underlying Wallerian degeneration following peripheral nerve injury is complex. Immune regulation on Wallerian degeneration is beneficial for early repair of perpheral nerve injury.OBJECTIVE: To investigate the effects of Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonist on Wallerian degeneration and axonal regeneration after early peripheral nerve injury in rats. METHODS: Fifty male Wistar rats were recruited and randomly divided into treatment group (n=20), model group (n=20) and sham group (n=10). The right sciatic nerves of rats in treatment and model groups were cut and sutured end-to-end, while the sciatic nerves of rats in sham group were only exposed. In the treatment group rats were intravenously injected with 0.15 mg/kg TAK-242 via tail vein 1 hour preoperatively and 7 days postoperatively, and the rats in the other two groups were given intravenous injection of the same volume of normal saline. The sciatic nerves were removed at 24 hours, 3, 4 and 7 days after surgery. Xiong Le, Studying for masters degree, Department of Immunology, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, ChinaCorresponding author: Zang Bei, M.D., Associate professor, Department of Immunology, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, ChinaRESULTS AND CONCLUSION: Real-time PCR indicated that the mRNA expressions of interleukin-1 and monocyte chemoattractant-1 were significantly increased in the model group compared with the sham group at 24 hours after surgery (both P 0.001), while the expressions were significantly decreased after TAK-242 injection (both P 0.001). Immunofluorescence showed that compared with the model group, down-regulated expression of CD68+ and iba1+ cells appeared in the treatment group at 3 days after surgery (P 0.01, P 0.05). Luxol fast blue staining revealed that demyelination at the sciatic nerve stump appeared in both model and treatment groups at postoperative 7 days, but myelin debris clearance in the treatment group was significantly reduced compared with the model group (P 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that a lot of inflammatory cells, Schwann cells and regenerated nerve fibers at the sciatic nerve stump were found in the model group, while there were few inflammatory cells, Schwann cells and regenerated nerve fibers in the treatment group at 7 days after surgery. Immunohistochemistry found that the expression of growth-associated protein-43 in the treatment group was significantly lower than that in the model group at 4 days postoperatively (P 0.05). Besides, compared with the model group, a significantly decreased sciatic functional index was found in the treatment group at 20, 30 and 40 days after surgery (P 0.05). These results show that TLR4 antagonists delay early nerve regeneration in rats after sciatic nerve injury probably by inhibiting the TLR4 signaling pathway. Subject headings: Peripheral Nerves; Toll-Like Receptor 4; Myelin Sheath; Tissue EngineeringFunding: the Science and Technology Program of High Educations in Shandong Province, No. J14LK10Cite this article: Xiong L, Zhang B, Shen RW, Ji AY, Sun GQ, Bian HL, Zhang FY, Wang Y, Huang H, Li HQ, Zhou SY, Shen ZK, Wang Z. Toll-like receptor 4 antagonist protects against Wallerian degeneration after peripheral nerve injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(42):6308-6316.6313ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)治療是顯微外科的難題之一。周?chē)窠?jīng)損傷后，遠(yuǎn)端神經(jīng)發(fā)生營(yíng)養(yǎng)障礙而出現(xiàn)軸突壞死，髓鞘崩解和鞘膜增生等一系列變化，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為瓦勒變性。瓦勒變性整個(gè)過(guò)程包括：軸索變性，主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)端軸索腫脹斷裂，吞噬細(xì)胞增生活躍吸收壞死組織；近端軸索近向遠(yuǎn)側(cè)長(zhǎng)出許多旁側(cè)和終末側(cè)支芽，并向遠(yuǎn)端延伸；軸突脫髓鞘崩解，吞噬細(xì)胞增生活躍吸收崩解產(chǎn)物；許旺細(xì)胞增殖活躍，向近端內(nèi)遷延形成Bungner帶，接觸引導(dǎo)再生軸突向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)，分泌因子引導(dǎo)再生纖維，募集血源性巨噬細(xì)胞很快聚集到神經(jīng)殘端，吞噬髓鞘碎屑；神經(jīng)纖維細(xì)胞增生排列。巨噬細(xì)胞在瓦勒變性與神經(jīng)再生過(guò)程中發(fā)揮吞噬變性組織、為再生神經(jīng)清除障礙的作用，而許旺細(xì)胞的增殖對(duì)軸突的再生和髓鞘的形成至關(guān)重要，二者對(duì)神經(jīng)再生都起著非常重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究關(guān)注周?chē)窠?jīng)損傷后，調(diào)節(jié)瓦勒變性和軸突再生的細(xì)胞和分子機(jī)制，從分子免疫學(xué)角度在損傷早期縮短瓦勒變性和神經(jīng)再生時(shí)間，提高神經(jīng)修速度及修復(fù)質(zhì)量，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。Toll樣受體(TLRs)作為一種模式識(shí)別受體，介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，除了識(shí)別病原相關(guān)分子模式外，也可識(shí)別損傷相關(guān)分子模式，如壞死細(xì)胞，熱休克蛋白(HSP60，HSP70)和細(xì)胞外基質(zhì)成分1，有趣的是，在神經(jīng)損傷部位存在大量壞死細(xì)胞，而壞死軸突表達(dá)熱休克蛋白60和熱休克蛋白70，并且在損傷組織的炎癥反應(yīng)部位產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)組分2。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)多種Toll樣受體3，而對(duì)于在外周神經(jīng)系統(tǒng)，許旺細(xì)胞上的Toll樣受體近來(lái)更受關(guān)注。在神經(jīng)損傷后，表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞上的Toll樣受體能最先感受到損傷軸突的損傷刺激。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在原代細(xì)胞培養(yǎng)條件下，取自出生后2到7 d新生大鼠坐骨神經(jīng)的許旺細(xì)胞中Toll樣受體4有較高表達(dá)，并且已有研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷時(shí)，脂多糖(Toll樣受體激動(dòng)劑)能促進(jìn)瓦勒變性過(guò)程中的髓鞘碎片的清除4，但目前關(guān)于外周神經(jīng)系統(tǒng)中Toll樣受體4作用的研究仍為數(shù)不多。因此，本研究著重關(guān)注外周神經(jīng)損傷后瓦勒變性早期，通過(guò)調(diào)控Toll樣受體4信號(hào)通路影響巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞的活化，從而對(duì)變性髓鞘碎片清除以及神經(jīng)再生產(chǎn)生的影響。眾所周知，周?chē)窠?jīng)損傷后的瓦勒變性過(guò)程中，巨噬細(xì)胞(局部和血源)和許旺細(xì)胞共同參與髓鞘碎片的清除5-7，已有研究證明神經(jīng)傷后1-3 d大量的巨噬細(xì)胞聚積，許旺細(xì)胞則在軸突斷裂后3 d達(dá)到增殖高峰，脫髓鞘反應(yīng)于7 d左右達(dá)到峰值。而損傷局部的巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞可在損傷早期產(chǎn)生白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1等炎性因子調(diào)節(jié)髓鞘碎片清除過(guò)程8，這些炎性因子在損傷后1 h即可出現(xiàn)，而在24 h表達(dá)量最高7-10。實(shí)驗(yàn)建立Wistar大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，通過(guò)注射TAK-242(Toll樣受體4拮抗劑)抑制大鼠Toll樣受體4信號(hào)通路,從損傷早期巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞募集，變性崩解髓鞘的清除，軸突再生及損傷后期運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)幾個(gè)方面探討Toll樣受體4信號(hào)通路對(duì)外周神經(jīng)損傷后瓦勒變性的免疫調(diào)控，為周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)提供一個(gè)新策略。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2015年9月至2016年2月在青島大學(xué)免疫教研室完成。1.3 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí) Wistar 雄性大鼠50只，體質(zhì)量(20020) g，由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(魯)20090007。 飼養(yǎng)于飼養(yǎng)箱，每箱5只大鼠，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，溫度為(222) ，相對(duì)濕度為60%，自由飲食與進(jìn)水，買(mǎi)回大鼠適應(yīng)環(huán)境 1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。試劑及儀器：TAK-242(美國(guó)Cayman Chemical公司)；Rabbit Anti-CD68，Rabbit Anti-iba1(北京博奧森生物技術(shù)公司)；Goat Anti-Rabbit IgG，F(xiàn)ITC Conjugated(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Premix Ex Taq熒光定量試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；石蠟切片機(jī)，冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 動(dòng)物分組 50只Wistar大鼠隨機(jī)分為處理組(20只)，模型組(20只)和假手術(shù)組(10只)。處理組大鼠分別在術(shù)前1 h及術(shù)后7 d連續(xù)尾靜脈注射0.15 mg/kg TAK-242，模型組及假手術(shù)組大鼠尾靜脈注射同等體積生理鹽水。1.4.2 周?chē)窠?jīng)損傷動(dòng)物模型制備 體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，用8%硫化鈉脫毛術(shù)區(qū)皮膚，消毒后將動(dòng)物俯臥位固定，無(wú)菌條件下顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)。處理組及模型組于梨狀肌下緣0.8 cm處用利刀橫行切斷坐骨神經(jīng)，以神經(jīng)外膜上走行的血管為標(biāo)記，用8-0無(wú)損傷縫合線行神經(jīng)外膜端端吻合，吻合口縫合4針(見(jiàn)圖1，箭頭表示吻合口)，逐層關(guān)閉切口，分別于建模成功后24 h、3 d、4 d和7 d處死；假手術(shù)組僅游離出坐骨神經(jīng)，然后關(guān)閉切口，于24 h處死。各組大鼠于術(shù)后24 h取下大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，迅速放入凍存管中在液氮中保存?zhèn)溆茫粚?duì)于處理組和模型組，于術(shù)后3 d處死后取出坐骨神經(jīng)，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h后，再依次放入20%和30%蔗糖中脫水，待脫水完全后包埋進(jìn)行冰凍切片；處理組和模型組大鼠分別于術(shù)后4 d和7 d，用40 g/L多聚甲醛全身灌注后，取坐骨神經(jīng)置于40 g/L多聚甲醛中固定待檢。圖1 大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型Figure 1 Model of sciatic nerve transection in rats圖注：A為完整神經(jīng)；B為橫斷神經(jīng)(箭頭所指)。BA1.5 主要觀察指標(biāo)1.5.1 大體觀察 觀察并記錄大鼠術(shù)后的存活情況，步態(tài)，術(shù)側(cè)肢體遠(yuǎn)端有無(wú)紅腫和潰瘍，肌肉有無(wú)萎縮，切口有無(wú)感染及下肢感覺(jué)的變化。 1.5.2 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)坐骨神經(jīng)白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1mRNA的表達(dá) 用Trizol法提取各組大鼠坐骨神經(jīng)總RNA。由TaKaRa公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，按照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(no.RR420A)熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。管家基因-actin是用來(lái)規(guī)范的總RNA量。引物序列：白細(xì)胞介素1上游引物：5-GCC AAC AAG TGG TAT TCT CCA-3下游引物：5-CCG TCT TTC ATC ACA CAG GA-3擴(kuò)增片段為118 bp； 單核細(xì)胞趨化蛋白1上游引物：5-AGG ACT TCA GCA CCT TTG A-3下游引物：5-TTC TCT GTC ATA CTG GTC ACT TC-3 擴(kuò)增片段為116 bp；-actin上游引物：5-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC-3下游引物：5-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3 擴(kuò)增片段為206 bp。反應(yīng)條件：95 預(yù)變性30 s，95 5 s，60 45 s，40個(gè)循環(huán)。每份RNA樣本均進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，取其平均Ct值用于結(jié)果分析，采用2-Ct方法對(duì)白細(xì)胞介素1、單核細(xì)胞趨化蛋白1mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。1.5.3 免疫熒光法測(cè)CD68+巨噬細(xì)胞和iba1+許旺細(xì)胞的表達(dá) 取神經(jīng)組織冰凍切片，用 磷酸鹽緩沖液(PBS)水化20 min；體積分?jǐn)?shù)10%羊血清40 封閉1 h；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入一抗后，4 孵育過(guò)夜；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入二抗 FITC山羊抗兔37 孵育2 h；磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次5 min；熒光封固劑封固，熒光顯微鏡觀察及照片拍攝，其中每一組數(shù)據(jù)均來(lái)源于3只大鼠至少4張切片染色結(jié)果，每張切片隨機(jī)取5個(gè)非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析免疫陽(yáng)性細(xì)胞面積占總面積比值。1.5.4 坐骨神經(jīng)髓鞘固蘭染色 以坐骨神經(jīng)縫合口為中心切取10 mm長(zhǎng)的神經(jīng)組織，遠(yuǎn)端緣用9-0無(wú)損傷縫線標(biāo)記方向，40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水、透明、進(jìn)一步石蠟包埋等過(guò)程制成石蠟切塊，做縱行切片連續(xù)切片，切片厚度為4 m，切片脫蠟后，然后作固蘭(Luxol fast blue，LFB)染色。用固蘭液在60 溫度浸泡12 h；隨后應(yīng)用體積95%乙醇浸洗5 min；加入0.05%碳酸鋰15 s；再應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗滌，蒸餾水漂洗，進(jìn)行脫水后，透明封固，在光鏡下觀察坐骨神經(jīng)的髓鞘改變，其中每一組數(shù)據(jù)均來(lái)源于3只大鼠至少4張切片染色結(jié)果，每張切片隨機(jī)取5個(gè)非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析固蘭染色陽(yáng)性區(qū)域的積分吸光度平均值。1.5.5 坐骨神經(jīng)病理學(xué)觀察 以坐骨神經(jīng)縫合口為中心切取10 mm長(zhǎng)的神經(jīng)組織，遠(yuǎn)端緣用9-0無(wú)損傷縫線標(biāo)記方向，40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水、透明、進(jìn)一步石蠟包埋等過(guò)程制成石蠟切塊，做縱行連續(xù)切片，切片厚度為4 m，然后作蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察坐骨神經(jīng)的基本結(jié)構(gòu)及有無(wú)細(xì)胞增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變。1.5.6 免疫組織化學(xué)法測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)蛋白的表達(dá) 制備蠟塊，4 m切片后進(jìn)行脫蠟、水化、PBS 沖洗及抗原修復(fù)等步驟。用正常的山羊血清和體積分?jǐn)?shù)3%的雙氧水各封閉20 min后加一抗4 過(guò)夜。次日用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔 lgG抗體室溫條件下孵育，20 min以后用磷酸鹽緩沖液洗3遍。用DAB液顯色后鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，適時(shí)終止反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染5 min后，進(jìn)一步進(jìn)行脫水、透明及封固等步驟，同時(shí)用磷酸鹽緩沖液代替一抗做相應(yīng)的陰性對(duì)照。顯微鏡下觀察生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43蛋白的表達(dá)，其中每一組數(shù)據(jù)均來(lái)源于3只大鼠至少4張切片染色結(jié)果，每張切片隨機(jī)取5個(gè)非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫陽(yáng)性區(qū)域的積分吸光度平均值。1.5.7 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)測(cè)定 制作長(zhǎng)約50 cm，寬約8.5 cm，高約8 cm的硬紙暗箱，兩端均留門(mén)，箱底墊上白紙，將大鼠雙后足蘸墨水后，在紙箱內(nèi)從一端到另一端行走，每條紙每側(cè)足留下四五個(gè)足印，選實(shí)驗(yàn)側(cè)及正常側(cè)足清晰的足印測(cè)量3個(gè)變量，精確 到mm，算出每只鼠各變量的平均值。術(shù)后10，20，30，40和50 d檢測(cè)，測(cè)量足印長(zhǎng)度(PL)，第1腳趾到第5腳趾的距離(TS)，第2足趾到第4足趾的距離(IT)，E和N分別代表實(shí)驗(yàn)側(cè)和正常側(cè)。將上述3個(gè)變量帶入Bain公式計(jì)算出SFI：SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS- NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。正常SFI為0，神經(jīng)功能完全喪失為-100。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均以s表示，采用方差分析或t 檢驗(yàn)分析，P 0.05的為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)選用Wistar大鼠50只，分為3組，實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)脫失，全部進(jìn)入結(jié)果分析。2.2 大體觀察 各組大鼠均發(fā)育良好，無(wú)死亡，切口甲級(jí)愈合。術(shù)后20 d內(nèi)，假手術(shù)組術(shù)后與術(shù)前基本無(wú)變化，無(wú)行動(dòng)困難、足趾攣縮及足踝部紅腫的表現(xiàn)，針刺足部反應(yīng)靈敏；處理組和模型組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)右下肢功能活動(dòng)受限，術(shù)側(cè)腿部肌肉均有萎縮現(xiàn)象，足趾攣縮不能伸展，呈拖曳步態(tài)，并出現(xiàn)不同程度右足踝部皮膚紅腫，足趾潰瘍，針刺反應(yīng)消失。術(shù)后40 d，處理組和模型組大鼠開(kāi)始出現(xiàn)潰瘍干燥，部分大鼠潰瘍愈合。術(shù)后50 d，模型組大鼠潰瘍?nèi)坑?，針刺反?yīng)靈敏；處理組仍有2只大鼠足趾未完全愈合，針刺反應(yīng)遲鈍。2.3 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)坐骨神經(jīng)組織白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 mRNA的表達(dá) 熔解曲線分析顯示2組基因擴(kuò)增均呈單峰，退火溫度一致，無(wú)非特異性擴(kuò)增。與假手術(shù)組相比，在術(shù)后24 h，模型組的白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P 0.001)。與模型組相比，處理組的白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 mRNA表達(dá)水平均差異降低(P 0.001)。結(jié)果見(jiàn)圖2。2.4 免疫熒光法測(cè)坐骨神經(jīng)組織CD68+巨噬細(xì)胞細(xì)胞和iba1+許旺細(xì)胞的表達(dá) 術(shù)后3 d神經(jīng)組織切片免疫特異性巨噬細(xì)胞 CD68 抗體和許旺細(xì)胞iba1抗體染色可見(jiàn)，模型組神經(jīng)斷端有大量CD68+巨噬細(xì)胞和iba1+許旺細(xì)胞浸潤(rùn)，而與模型組相比，處理組CD68+巨噬細(xì)胞和iba1+許旺細(xì)胞均明顯減少。通過(guò)定量，分析距離損傷中心2 mm內(nèi)遠(yuǎn)端免疫陽(yáng)性細(xì)胞面積所占比值顯示，處理組CD68+巨噬細(xì)胞明顯減少(P 0.01)，處理組iba1+許旺細(xì)胞也明顯減少(P 0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3。2.5 大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘固蘭染色 術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)固蘭染色可見(jiàn)，髓鞘呈天藍(lán)色，軸突不著色，背景為白色,反映在坐骨神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端崩解的髓鞘碎片被巨噬細(xì)胞清除的情況。假手術(shù)組大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，厚度均一，模型組和處理組神經(jīng)斷端可見(jiàn)髓鞘淡染，均為變性崩解的髓鞘，與模型組相比，處理組殘余髓鞘碎片較多(方框內(nèi)表示兩組殘余髓鞘差異)，通過(guò)定量分析，計(jì)算距離損傷中心2 mm內(nèi)遠(yuǎn)端被染色髓鞘的積分吸光度平均值，可見(jiàn)與模型組相比，處理組殘余髓鞘碎片較多，差異有顯著性意義(P 0.05)，反映了處理組的崩解髓鞘碎片清除速率明顯降低模型組。結(jié)果見(jiàn)圖4。2.6 大鼠坐骨神經(jīng)組織蘇木精-伊紅染色 術(shù)后7d蘇木精-伊紅染色可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)完整，纖維排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組和處理組軸突完全斷裂，髓鞘崩解，模型組較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，許旺細(xì)胞增殖活躍，纖維組織增生明顯，有神經(jīng)纖維生長(zhǎng)通過(guò)吻合口，顯示了正常的神經(jīng)斷端修復(fù)狀態(tài)；處理組可見(jiàn)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量許旺細(xì)胞增生，吻合口間仍有縫隙，神經(jīng)斷端修復(fù)較差。結(jié)果見(jiàn)圖5。2.7 免疫組織化學(xué)法測(cè)坐骨神經(jīng)組織生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)蛋白的表達(dá) 用距離神經(jīng)斷端4 mm處坐骨神經(jīng)橫切片的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43表達(dá)水平來(lái)衡量軸突再生情況。術(shù)后4 d免疫組織化學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)，免疫組織化學(xué)圖片背景潔凈，幾乎無(wú)非特異性染色。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43免疫陽(yáng)性產(chǎn)物，均呈深褐色，主要分布于軸突內(nèi)，生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43主要定位于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)。通過(guò)定量分析，計(jì)算免疫陽(yáng)性細(xì)胞的積分吸光度平均值可見(jiàn)，與模型組相比，處理組中生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43蛋白表達(dá)均顯著降低(P 0.05) 。結(jié)果見(jiàn)圖6。 2.8 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)測(cè)定 模型組和處理組大鼠在術(shù)后10，20，30，40和50 d，行足跡實(shí)驗(yàn)分析坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。各組大鼠行走時(shí)步態(tài)穩(wěn)定，足跡清晰。結(jié)果顯示，在坐骨神經(jīng)損傷后10 d，兩組大鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)均為最低值，之后開(kāi)始逐步上升。處理組在損傷后20，30和40 d，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)均分別明顯低于模型組(P 0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖7。模型組 處理組單核細(xì)胞趨化蛋白 白細(xì)胞介素1坐骨神經(jīng)功指數(shù)(SFI)基因相對(duì)表達(dá)水平0-50-100-1504003002001000aaaaabb0 20 40 60假手術(shù)組 模型組 處理組損傷后時(shí)間圖2 大鼠坐骨神經(jīng)組織中白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1mRNA的表達(dá)Figure 2 mRNA expression levels of interleukin-1 and monocyte chemoattractant-1 in sciatic nerve tissue of rats圖注：與假手術(shù)組相比，aP 0.001；與模型組相比，bP 0.001。圖7 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)檢測(cè)Figure 7 Sciatic functional indexes of rats圖注：與模型組相比，aP 0.05。0.002 00.001 50.001 00.000 50bACB圖3 大鼠坐骨神經(jīng)組織中CD68+和iba1+細(xì)胞的表達(dá)(200)Figure 3 The expressions of CD68+ and iba1+ cells in sciatic nerve tissue of rats (200)圖注：圖A為模型組；B為處理組；C為CD68+巨噬細(xì)胞半定量分析；D為模型組；E為處理組；F為iba1+許旺細(xì)胞半定量分析。與模型組相比，aP 0.05，bP 0.01。CD68(單位面積)模型組 處理組0.0250.0200.0150.0100.0050DFEIba1(單位面積)a模型組 處理組D0.060.040.020LFBaBAC模型組 處理組圖4 大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘染色結(jié)果(箭頭表示橫斷部位，方框內(nèi)表示兩組殘余髓鞘差異，固蘭染色，40)Figure 4 The staining results of sciatic nerve myelin in rats (Luxol fast blue staining, 40)圖注：圖A為假手術(shù)組；B為模型組； C為處理組；D為髓鞘陽(yáng)性染色半定量分析。與模型組相比，aP 0.05。CBA圖5 大鼠坐骨神經(jīng)組織病理變化(箭頭指神經(jīng)斷端,蘇木精-伊紅染色，100)Figure 5 Morphological changes of sciatic nerve tissues in rats (hematoxylin-eosin staining, 100)圖注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為處理組。CBA圖6 大鼠坐骨神經(jīng)組織中生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43蛋白的表達(dá)(SP，400)Figure 6 The expression of growth-associated protein-43 in sciatic nerve tissue of rats (immunohistochemistry, 400)圖注：圖A模型組；B為處理組；C為GAP-43免疫陽(yáng)性細(xì)胞半定量分析。與模型組相比，aP 0.05。0.100.080.060.040.020GAP-43I(A)a模型組 處理組3 討論 Discussion神經(jīng)系統(tǒng)疾病危害人類(lèi)健康，周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)過(guò)程復(fù)雜，顯微外科手術(shù)可以恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性，但功能的恢復(fù)不盡人意。近年來(lái)，隨著神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程所涉及的分子機(jī)制的深入研究，從分子生物學(xué)的角度調(diào)控神經(jīng)再生備受關(guān)注。最近的研究表明，在周?chē)窠?jīng)損傷后，固有免疫系統(tǒng)通過(guò)炎性遞質(zhì)參與了瓦勒變性11-12，從而影響神經(jīng)再生。國(guó)外學(xué)者利用化學(xué)試劑注射以及免疫注射坐骨神經(jīng)擠壓模型大鼠，使其產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)利用上述方法處理?yè)p傷神經(jīng)，神經(jīng)修復(fù)時(shí)間明顯縮短，修復(fù)速度和質(zhì)量有明顯提高。而作者實(shí)驗(yàn)則從Toll樣受體角度，關(guān)注調(diào)控固有免疫反應(yīng)對(duì)早期瓦勒變性及神經(jīng)再生的影響。Toll樣受體4屬于Toll樣受體家族，是型膜受體，Toll樣受體家族由Medzhitov等13首次在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。Toll樣受體信號(hào)通路除了識(shí)別外源性配體，也可識(shí)別內(nèi)源性配體，而神經(jīng)損傷部位的內(nèi)源性配體可激活相應(yīng)的Toll樣受體，啟動(dòng)瓦勒變性過(guò)程中的先天免疫反應(yīng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞中Toll樣受體4表達(dá)最為豐富14-15；在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，Toll樣受體4主要表達(dá)于許旺細(xì)胞。Toll樣受體4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，有研究顯示Toll樣受體4信號(hào)通路參與缺血再灌注腦損傷過(guò)程16，可能參與新生兒缺血缺氧性腦病的發(fā)生發(fā)展和繼發(fā)性腦損傷的免疫炎癥反應(yīng)過(guò)程及腦損傷后的神經(jīng)修復(fù)的調(diào)控17，亞低溫治療能通過(guò)調(diào)控Toll樣受體4信號(hào)通路減輕大鼠腦出血后血腫周?chē)X組織的炎癥反應(yīng)18，還有研究表明，Toll樣受體介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)參與了阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)變性疾病和多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展19，而在外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究仍為數(shù)不多。為探討Toll樣受體4在周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮的作用，實(shí)驗(yàn)抑制大鼠體內(nèi)Toll樣受體4信號(hào)通路，檢測(cè)受損神經(jīng)瓦勒變性及軸突再生修復(fù)情況。TAK-242是一種的小分子化合物，可以結(jié)合Toll樣受體4受體胞內(nèi)段的 Cys747 位點(diǎn)從而阻斷Toll樣受體4信號(hào)通路20。最近已有研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，TAK-242能穿過(guò)血腦屏障，阻斷Toll樣受體4信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腦缺血/再灌注損傷21，但目前尚無(wú)通過(guò)體內(nèi)注射TAK-242，調(diào)控周?chē)窠?jīng)疾病的相關(guān)報(bào)道。接下來(lái)，研究從周?chē)窠?jīng)損傷后瓦勒變性過(guò)程中炎性因子的產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞募集，髓鞘碎片清除，以及軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)5個(gè)方面，來(lái)探究TLR4通過(guò)調(diào)節(jié)瓦勒變性對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)所產(chǎn)生的影響。作者利用Wistar大鼠建立坐骨神經(jīng)損傷模型，首先檢測(cè)尾靜脈注射TAK-242后對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)上相關(guān)炎性因子的表達(dá)影響。在周?chē)窠?jīng)損傷后，許旺細(xì)胞活化可分泌白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1，是Toll樣受體4信號(hào)通路下游的炎癥因子，由核因子B活化后轉(zhuǎn)位到核內(nèi)15，22-23。并且有研究顯示，白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1對(duì)巨噬細(xì)胞募集和髓鞘碎片清除必不可少22，24-25。Carroll等9的研究表明在坐骨神經(jīng)損傷后1.5 h已經(jīng)有單核細(xì)胞趨化蛋白1mRNA的早期表達(dá)，在24 h表達(dá)量最高，因此研究在術(shù)后24 h利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)組織上白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1的基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在坐骨神經(jīng)損傷后24 h，與假手術(shù)組相比，模型組白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 mRNA表達(dá)明顯升高。而與模型組相比，注射TAK-242后白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1 mRNA表達(dá)明顯降低。說(shuō)明周?chē)窠?jīng)損傷后，體內(nèi)注射Toll樣受體4拮抗劑可有效減少白細(xì)胞介素1和單核細(xì)胞趨化蛋白1的分泌。周?chē)窠?jīng)損傷后，崩解的髓鞘碎片上可能存在抑制軸突再生的因子，及時(shí)清除變性的髓鞘為軸突的再生提供更有利的環(huán)境4，研究表明在周?chē)窠?jīng)損傷后的瓦勒變性過(guò)程中，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是清除變性神經(jīng)髓鞘碎片主要細(xì)胞之一6-7，26，而以往的研究結(jié)果也表明，巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞等在神經(jīng)損傷后發(fā)生的瓦勒變性過(guò)程中，對(duì)促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)和再生中發(fā)揮著不可替代的作用4。已有研究證明在神經(jīng)傷后1-3 d大量的巨噬細(xì)胞聚積，而損傷后3 d是許旺細(xì)胞增殖高峰期，脫髓鞘反應(yīng)于7 d左右達(dá)到峰值。因此研究在術(shù)后第3天采用免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞的募集，結(jié)果顯示與模型組相比，在神經(jīng)斷端處理組CD68+細(xì)胞和iba1+細(xì)胞數(shù)均明顯降低，說(shuō)明可能通過(guò)抑制Toll樣受體4通路，明顯減少瓦勒變性過(guò)程中巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞的募集。同時(shí)術(shù)后第7 天坐骨神經(jīng)固蘭染色表明，與模型組相比，處理組殘余髓鞘碎片明顯增加，表明處理組髓鞘碎片清除率明顯降低，與上述CD68+細(xì)胞和iba1+細(xì)胞數(shù)量減少保持一致。而術(shù)后第7 天坐骨神經(jīng)蘇木精-伊紅染色也看出，模型組許旺細(xì)胞增殖活躍，吻合口有神經(jīng)纖維通過(guò)，處于正常的神經(jīng)斷端修復(fù)狀態(tài)，而處理組纖維再生較少，吻合口有明顯縫隙，神經(jīng)斷端修復(fù)能力明顯減弱。這些結(jié)果說(shuō)明了Toll樣受體4抑制劑導(dǎo)致受損神經(jīng)斷端巨噬細(xì)胞及許旺細(xì)胞募集減少，崩解變性的髓鞘碎片清除率降低，從而使神經(jīng)斷端修復(fù)能力降低。以上結(jié)果都說(shuō)明，周?chē)窠?jīng)損傷后，Toll樣受體4信號(hào)可以通過(guò)對(duì)瓦勒變性早期的免疫調(diào)控影響受損神經(jīng)斷端的修復(fù)。其次，作者驗(yàn)證TAK-242抑制瓦勒變性過(guò)程導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞減少及髓鞘清除延遲后，是否會(huì)影響該過(guò)程中的軸突再生。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43是內(nèi)源性神經(jīng)元生長(zhǎng)依賴(lài)蛋白，參與軸突生長(zhǎng)和突觸形成，被認(rèn)為參與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)27，可介導(dǎo)再生神經(jīng)纖維生長(zhǎng)錘的黏附、生長(zhǎng)及對(duì)再生信號(hào)的反應(yīng)28，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程或突觸重建過(guò)程中呈高表達(dá)狀態(tài)，發(fā)育完成后表達(dá)明顯降低。作者用距離神經(jīng)斷端4 mm處生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43的表達(dá)水平來(lái)衡量軸突再生情況，Krekoski等26曾用類(lèi)似的方法評(píng)價(jià)軸突再生。神經(jīng)再生開(kāi)始于損傷后第4天30，因此實(shí)驗(yàn)在術(shù)后4 d通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與模型組相比，處理組生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43的表達(dá)水平降低，說(shuō)明可能通過(guò)抑制Toll樣受體4通路，導(dǎo)致神經(jīng)斷端巨噬細(xì)胞和許旺細(xì)胞數(shù)量減少，髓鞘碎片清除延遲，在此環(huán)境下影響了軸突再生水平?？梢酝茢啵?chē)窠?jīng)損傷后，Toll樣受體4信號(hào)通路可以調(diào)控瓦勒變性影響早期軸突再生，對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)具有重要的意義。最后探究以上對(duì)瓦勒變性過(guò)程的干預(yù)是否影響后期大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)反映下肢協(xié)調(diào)功能和肌力恢復(fù)情況，是從行為學(xué)的角度評(píng)價(jià)周?chē)窠?jīng)功能的可靠指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，處理組大鼠在20、30和40 d坐骨神經(jīng)功能指數(shù)同期均明顯低于模型組，提示抑制Toll樣受體4信號(hào)通路后最終可能影響運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。說(shuō)明周?chē)窠?jīng)損傷后，Toll樣受體4信號(hào)通路調(diào)控瓦勒變性和軸突再生，最終可能會(huì)影響后期運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠體內(nèi)注射拮抗劑抑制Toll樣受體4信號(hào)通路，從對(duì)瓦勒變性早期炎性因子產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞募集，髓鞘碎片清除，以及軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)5方面的影響，解釋了Toll樣受體4在周?chē)窠?jīng)受損后瓦勒變性過(guò)程中的重要意義。周?chē)窠?jīng)損傷后，究竟是哪種內(nèi)源性配體引起Toll樣受體4信號(hào)的活化尚不