大腸菌群經典三步法和LST兩步法的比較與評價 第一組 PPT制作 成都中醫(yī)藥大學PPT演講 試驗菌種 培養(yǎng)基培養(yǎng) 稀釋 混勻待用 設置空白對照與多個平行 樣品制備 檢驗過程 樣品 三步法 兩步法 乳糖發(fā)酵 平板分離 證實試驗 初發(fā)酵 復發(fā)酵 查MPN檢索樣品中的總大腸菌群MPN值 統(tǒng)計學方法計算 試驗樣品 按照不同模擬污染水平進行人工添加 需氧及兼性厭氧 在37 能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌 一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌 檸檬酸桿菌 產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等 它不代表某一個或某一屬細菌 而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌 以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染 大腸菌群數的高低 表明了糞便污染的程度 也反映了對人體健康危害性的大小 廣泛應用于食品衛(wèi)生工作 樣品制備 1 試驗樣品種類與數量選擇為了模擬大腸菌群在不同樣品中生長環(huán)境不同 樣品組成不同 選用種類不同的樣品 如水 食物 化妝品等 食物樣品又可分為肉類 乳制品 水產品 淀粉類 蔬果類等 同時避免選擇添加了防腐劑的樣品 選擇合適的種類數與數量 處理前經檢驗確定無大腸菌群與干擾菌或進行高壓蒸汽滅菌 2 空白試驗在分析工作中 存在著系統(tǒng)誤差 包括試劑及用水含有雜質所造成的誤差等 為消除這部分影響 提高分析準確度 所以要做空白試驗 樣品制備 3 菌株選擇將大腸菌群標準菌株 包括大腸埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌 陰溝腸桿菌 弗氏檸檬酸桿菌 于培養(yǎng)基中35 培養(yǎng)24h后混合 4 菌落計數用滅菌的磷酸鹽緩沖液 磷酸鹽緩沖液比生理鹽水 NS 合適 因為PBS在稀釋的同時可以保護菌體 調節(jié)pH值 而且市面上有成品出售 而NS只是純粹的稀釋液 進行十倍系列稀釋至10 10 用后4個稀釋度 用營養(yǎng)瓊脂計數 每種濃度吸取1mL加到融化溫度46 的15mL左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻凝固 35攝氏度培養(yǎng)24h 取出進行菌落計數 趙貴明 邊凌淳 應用不同方法檢測食品中大腸菌群結果的比較 微生物學雜志 2003年11月第23卷第6期 樣品制備 菌落計數流程圖 1 選擇平均菌落數在30 300之間者進行計算 若只有一個稀釋度平均菌落數符合此范圍 則將該菌落數乘以稀釋倍數報告 2 若有二個稀釋度均在30 300之間時 按國家標準方法要求應以二者比值決定 比值小于或等于2取平均數 比值大于2則取較小數字 3 若所有稀釋度均不在計數區(qū)間 如均大于300 則取最高稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之 如均小于30 則以最低稀釋度的平均菌落數乘稀釋倍數報告之 如菌落數均不在30 300之間 則應以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之 如所有稀釋度均無菌落生長 則報告未檢出 檢樣 樣品制備 5 試驗樣品制備按照不同樣品類別分別按規(guī)定加入磷酸緩沖液處理 每份樣品分高 中 低三個水平進行菌懸液人工添加 高度污染為添加600 1200CFU g 中度污染添加120 600CFU g 低度污染添加30 120CFU g 以保證樣品含菌數量在檢測范圍內 同時用相同樣品做三份平行試驗與一份空白試驗 均質后 18 保存?zhèn)溆?試驗前用無菌磷酸緩沖液稀釋至10 3 檢驗方法 三步法與兩步法 三步法 水樣接種到雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中培養(yǎng) 產酸產氣的發(fā)酵管轉種在伊紅美藍瓊脂平板上培養(yǎng) 挑選可疑菌落染色 鏡檢 證實試驗 乳糖發(fā)酵試驗 分離培養(yǎng) 證實試驗 兩步法 接種月桂基硫酸鹽胰蛋白胨 LST 肉湯培養(yǎng) 從產氣的LST肉湯管中取培養(yǎng)物移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯 BGLB 管中培養(yǎng) 初發(fā)酵試驗 復發(fā)酵試驗 三步法所用培養(yǎng)基及其作用 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白胨 提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求牛肉膏 提供碳源乳糖 大腸菌群可分解的糖類氯化鈉 可維持均衡的滲透壓溴甲酚紫乙醇溶液 產酸指示劑蒸餾水 溶劑伊紅美藍培養(yǎng)基蛋白胨 提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求乳糖 大腸菌群可分解的糖類磷酸氫二鉀 中和過量酸瓊脂 培養(yǎng)基固化劑蒸餾水 溶劑伊紅水溶液 大腸菌群特異性指示劑美藍水溶液 大腸菌群特異性指示劑 兩步法所用培養(yǎng)基及其作用 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨 LST 肉湯胰蛋白胨或胰酪胨 提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求氯化鈉 可維持均衡的滲透壓乳糖 大腸菌群可發(fā)酵的糖類磷酸氫二鉀 K2HPO4 緩沖劑磷酸二氫鉀 KH2PO4 緩沖劑月桂基硫酸鈉 抑制非大腸菌群細菌的生長蒸餾水 溶劑煌綠乳糖膽鹽 BGLB 肉湯蛋白胨 提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求乳糖 大腸菌群可發(fā)酵的糖類牛膽粉 oxgall或oxbile 溶液 抑制非腸桿菌科細菌0 1 煌綠水溶液 抑制非腸桿菌科細菌蒸餾水 溶劑 兩步法所用培養(yǎng)基可否添加指示劑 對于LST而言 大腸菌群分解乳糖產酸產氣 如果用指示劑一般就是用酸堿指示劑 LST培養(yǎng)基里有月桂基硫酸鈉 SDS十二烷基硫酸鈉 它是陰離子表面活性劑 水溶液呈堿性 為了讓大腸菌群生長 培養(yǎng)基里就需要用磷酸緩沖液維持PH中性 所以加了酸堿指示劑也沒有什么用 對于BGLB而言 BGLB中的煌綠本身就是指示劑 在培養(yǎng)基中呈綠色 它的指示范圍是0 0 黃 2 6 綠 一般培養(yǎng)過程中都是綠色 不具有典型性和代表性 但是也有少數情況培養(yǎng)出來酸產生的過多變成了黃色 所以加了指示劑可能會干擾現(xiàn)象觀察 加之大腸菌群分解乳糖產酸產氣 有氣泡就能判斷 不用加指示劑 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨 LST 煌綠乳糖膽鹽 BGLB 肉湯這兩種培養(yǎng)基相對于乳糖膽鹽蛋白胨水有什么特別之處 LST BGLB 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的區(qū)別 1 氮源區(qū)別BGLB與乳糖蛋白胨培養(yǎng)基氮源為蛋白胨 LST培養(yǎng)基氮源為胰蛋白胨 蛋白胨是將肉 酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃色的粉劑 胰蛋白胨 又稱胰酪蛋白胨 胰酶消化酪蛋白胨 是一種優(yōu)質蛋白胨 是以新鮮牛肉和牛骨經胰酶消化 濃縮干燥而成的淺黃色粉末 主要區(qū)別在于 胰蛋白胨處理后 很多大分子的蛋白分子量變小 這樣的話 細菌更容易利用 價格較蛋白胨貴 LST BGLB 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的區(qū)別 2 培養(yǎng)基中的抑制劑區(qū)別LST培養(yǎng)基中為月桂基硫酸鈉 SDS 為陰離子表面活性劑 有表面活性作用 有利于提高革蘭陰性菌活性與分散菌體的作用 就有更好的分離效果 所以作為鑒別的培養(yǎng)基 BGLB中煌綠是一種抑菌劑 主要抑制革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌 由于本培養(yǎng)基的抑菌作用非常強 所以可以排除一些假陽性的結果 常用作確證試驗 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中沒有加入抑制劑 所以需要用伊紅美藍培養(yǎng)基做特異性鑒別 三步法流程圖 檢樣 稀釋 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基 36 1 24h 2h 不產氣 大腸菌群陰性 產氣 伊紅美蘭瓊脂平板 報告 36 1 18h 24h 革蘭氏染色 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基 革蘭氏陽性 革蘭氏陰性無芽孢桿菌 大腸菌群陰性 報告 大腸菌群陽性 產酸產氣 不產酸產氣 報告 36 1 24h 2h 大腸菌群陰性 報告 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中大腸菌群生長現(xiàn)象 大腸菌群分解乳糖蛋白胨培養(yǎng)基產酸產氣 溴甲酚紫是pH指示劑 酸性呈黃色 堿性呈紫色 大腸菌群發(fā)酵后呈黃色 空白對照呈紫色 大腸菌群發(fā)酵后產氣 倒管內有氣泡 空白對照則無氣泡 伊紅美藍培養(yǎng)基上大腸菌群菌落現(xiàn)象 當大腸桿菌分解乳糖產酸時細菌帶正電荷被染成紅色 再與美藍結合形成紫黑色菌落 并帶有綠色金屬光澤 檢樣 25g 或25ml 樣品 225ml稀釋液 均質 10倍系列稀釋 選擇適宜三個連續(xù)稀釋度的樣品勻液 接種LST肉湯管 36 1 48h 2h 不產氣 產氣 BGLB肉湯 36 1 大腸菌群陰性 大腸桿菌陽性 不產氣 產氣 查MPN表 報告結果 兩步法流程圖 48h 2h 大腸菌群在LST培養(yǎng)基中現(xiàn)象 大腸菌群在LST培養(yǎng)基中產氣 倒管內有氣泡 大腸菌群在BGLB培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象 大腸菌群分解乳糖產酸產氣 陽性結果倒管內均有氣泡 若產酸過多 由于有指示劑煌綠存在 指示范圍pH0 0黃 2 6綠 則由綠色變?yōu)辄S色 右 結果計數 前提 若空白對照無大腸菌群檢出 證明實驗無系統(tǒng)誤差干擾 結果準確性可以保證 計算三步法與兩步法最終確證的大腸菌群陽性管數 檢索國標中的MPN表 統(tǒng)計好每個樣品MPN數 根據樣品制備時加入的不同梯度 高 中 低 菌落形成單位與查詢MPN表 看實際添加菌落形成單位是否落在MPN表的95 置信區(qū)間內 統(tǒng)計好兩個方法落在范圍外以及陰性管數與陽性管數 MPN表 MPN MostProbableNumber 最大可能數 統(tǒng)計學方法評價 將統(tǒng)計結果整理為四格表對檢驗結果進行卡方檢驗 屬性 合計 組別 三步法 兩步法 落在95 置信區(qū)間內陽性樣品數 落在95 置信區(qū)間外陽性樣品及陰性樣品數 a T11 c T21 b T12 d T22 n1 a b n2 c d 合計 m1 a c m2 b d n a b c d 統(tǒng)計學方法評價 建立假設 H0 1 2 兩種方法檢出率相同H1 1 2 兩種方法檢出率不相同 0 05計算各個格子理論頻數TijT11 n1m2 nT12 n1m2 nT21 n2m1