密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 a o. a y A of 國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 I 目 錄 目錄 中文摘要 英文摘要 第一章 引言 1 第二章 菌寄生過程中相關(guān)酶的篩選 7 材料 7 方法 9 一、 板對峙培養(yǎng)觀察菌落互作 9 二、平板透明圈法檢測酶活性 9 三、比色法測定酶活性 9 四、蛋白質(zhì)含量測定 11 結(jié)果 11 一、平板對峙培養(yǎng) 11 二、平板法檢測幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶活性 12 三、比色法測定相關(guān)酶活性 13 討論 15 第三章 葡聚糖酶的純化 16 材料 16 方法 16 一、兩棲 單頂孢產(chǎn)葡聚糖酶條件的測定 16 二、葡聚糖酶的純化 17 三、蛋白質(zhì)的氨基端氨基酸序列分析 19 結(jié)果 19 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 、兩棲單頂孢產(chǎn)葡聚糖酶條件的測定 20 二、葡聚糖酶的純化 22 三、葡聚糖酶 氨基 端氨基酸序列 25 討論 25 第四章 葡聚糖酶的性質(zhì)研究 26 材料 26 方法 26 一、溫度對葡聚糖酶 影響 26 二、 葡聚糖酶 影響 26 三、金屬離子對葡聚糖酶 活的影 27 四、葡聚糖酶 測定 27 五、葡聚糖酶的抗病原真菌的作用 27 結(jié)果 27 一、溫度對葡聚糖酶 影響 27 二、 葡聚糖酶 影響 28 三、金屬離子對葡聚糖酶 性的影 30 四、葡聚糖酶 測定 30 五、葡聚糖酶對病原菌的作用 31 討論 31 參考文獻 3 3 附錄 39 致謝 41中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 要 本論文對食線蟲真菌兩棲單頂孢（ 寄生的酶學機 理進行了研究。 平板對峙法培養(yǎng)兩棲單頂孢和核盤菌，表明兩棲單頂孢對核盤菌生長有抑制作用。在以菌核粉為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)兩棲單頂孢并連續(xù)測定各酶的活性，結(jié)果只有葡聚糖酶的活性較為顯著且隨著培養(yǎng)時間的延長酶活性明顯變化。說明葡聚糖酶在兩棲單頂孢的菌寄生過程中起重要作用。 從培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)時間和初始 三方面對兩棲單頂孢產(chǎn)葡聚糖酶的條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明以麩皮粉為誘導物、 28 180蕩培養(yǎng) 4 天、初始 為 6 時產(chǎn)酶量最大。 通過硫酸銨沉淀、 膠過濾脫鹽和陰離子 交換柱層析對葡聚糖酶進行了分離純化，得到了兩種葡聚糖同工酶。 泳檢驗結(jié)果表明，一種同工酶得到了純化 , 定名為 子量為 33右，其氨基端氨基酸序列為 N P C Y L G S F Q T。另一種同工酶得到了部分純化。 對葡聚糖酶 特性進行研究，結(jié)果表明該葡聚糖酶的最適反應溫度為 70，最適反應 于 70和 該酶比較穩(wěn)定， 性有促進作用， 性有強烈的抑制作用。該酶對昆布多糖底物的 為 生測實驗表明，兩棲單頂孢所產(chǎn)生的葡聚糖酶粗酶液可明顯抑制立枯絲核菌菌絲的生長，使其膨脹破裂，表明葡聚糖酶在兩棲單頂孢的菌寄生過程中起重要作用。但對其中一種得到純化的葡聚糖同工酶的生測結(jié)果表明，其抑菌效果不明顯，對這一現(xiàn)象的產(chǎn)生本文進行了深入的討論。 關(guān)鍵詞：食線蟲真菌 兩棲單頂孢 菌寄生 葡聚糖酶 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 he a of in of of of a . in as an in of on , 8 80as of by is 3 000 N P C Y L G S F Q T. 0 0 pH to to as m of G1 of an in of . in to to 國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 1 第一章 引 言 真菌是植物的重要病原物，在植物病害中由真菌引起的病害數(shù)量最多，幾乎每種作物都有幾種真菌病害。 同時植物寄生線蟲也對多種農(nóng)林植物造成重大危害，據(jù) 守估計，全世界每年因線蟲危害對糧食和纖維作物造成的損失大約為 12%，對 蔬菜、花生和某些果樹造成的損失要超過 20%。 自 20 世紀 40 年代以來，對病蟲害的防治主要依賴化學農(nóng)藥。 但隨著社會的發(fā)展，化學農(nóng)藥的種種弊端引起了人們的認識和廣泛關(guān)注，如環(huán)境污染、生態(tài)破壞、對人畜的毒害、病原物產(chǎn)生抗藥性等等。 因此，防病殺線多功能生防菌的開發(fā)利用受到關(guān)注。 1978 年， 978) 首次發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)條件下捕食線蟲真菌 少孢節(jié)叢孢（ 強力節(jié)叢孢（ A. 多孢節(jié)叢孢（ A. 平板上不但能以粘性 菌網(wǎng)捕食植物寄生線蟲也可以通過菌環(huán)寄生于 枯絲核菌（ 地霉屬真菌（ 等病原真菌上，為防病殺線多功能生防菌的開發(fā)提供了依據(jù)。 1食線蟲菌物概況 食線蟲菌物是指寄生、捕捉、定殖和毒害線蟲的一類微生物，在自然界中廣泛存在并對線蟲的群體數(shù)量具有重要的調(diào)控作用 (。 1839 年，著名葡萄牙菌物學家 C. 立了食線蟲真菌的第一個屬 節(jié)叢孢屬（ 。 到目前為止，世界已報 道的食線蟲菌物約 400 種，我國已報到的約 120 種。 食線蟲菌物經(jīng)長期的進化形成了功能多樣的不同類群，主要有以營養(yǎng)菌絲特化形成捕食器捕捉線蟲，通過成囊孢子、粘性孢 (987)子、吞噬孢子和注射孢子侵染線蟲，通過分泌毒素消解或定殖線蟲。 有關(guān)食線蟲菌物的代謝研究較少，僅有少量關(guān)于酶的產(chǎn)生及次生代謝產(chǎn)物的研究。1969）測定了 12 種寄生線蟲菌物的纖維素酶活性，結(jié)果表明所有測試菌都可以產(chǎn)生纖維素酶。 1996）分別測定了 44 株食線蟲菌物的纖維素酶活性及 30 株菌物的木質(zhì)素裂解酶活 性，結(jié)果表明所有供試菌株都產(chǎn)生纖維素酶，僅有 2 株具有木質(zhì)素裂解酶活性。 已經(jīng)證明膠原酶能夠降解線蟲體壁影響植物寄生線蟲的存活、游動及卵孵化，膠原酶可能與食線蟲菌物侵入線蟲有關(guān)。 一些學者對食線蟲菌物降解線蟲體壁及卵鞘的蛋白酶進行了純化和定性，發(fā)現(xiàn)這些酶均屬于絲氨酸蛋白酶中的枯草桿菌蛋白酶類，并具有很高的同源性。幾丁質(zhì)酶在線蟲侵染中的重要性已經(jīng)從幾丁質(zhì)酶活水平與致病性的正相關(guān)以及植物與細菌幾丁質(zhì)酶對卵和幼蟲的影響中得到證明。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 2 2菌寄生菌概況 菌寄生菌是指生長于其它菌物上，并從其獲得營養(yǎng)的一類菌物。 一種菌 物寄生于另一種菌物上的現(xiàn)象叫菌寄生或重寄生。 寄生物叫菌寄生菌，被寄生物叫寄主菌物。 早在兩百多年以前菌物學家就發(fā)現(xiàn)了這類菌物，但真正對其研究則始于 19 世紀 60 年代。 它作為植物病害生物防治的重要機制之一，已經(jīng)受到越來越的重視。 根據(jù)寄生方式和對寄主的影響，菌寄生菌可分為不同類型。 1985）和 1988）將菌寄生分為活體營養(yǎng)菌寄生和死體營養(yǎng)菌寄生。活體營養(yǎng)的菌寄生菌從活的寄主菌物細胞內(nèi)獲取養(yǎng)料。根據(jù)從寄主菌物獲取營養(yǎng)的方式不同，又分為內(nèi)生性、吸器性和接觸性。這類寄生菌一 般具有高度的寄生?；裕瑑H能寄生于某一種或者少數(shù)幾種近緣的菌物。死體營養(yǎng)菌寄生菌是以酶解或產(chǎn)生有毒物質(zhì)來殺死寄主，再從死亡的寄主細胞中吸收所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，這類菌寄生菌的寄主范圍大，寄主專化性低，一般不產(chǎn)生特異性的侵染結(jié)構(gòu)。 菌寄生菌對寄主菌的作用機制包括寄主菌形態(tài)學上的畸變、對菌絲的附著生長、侵入并產(chǎn)生吸器、菌絲的溶解，以及產(chǎn)生酶和抗生物質(zhì)等。自 1932 年（ 1932）發(fā)現(xiàn)木霉對其它土壤真菌的寄生現(xiàn)象以來已報道了大量的菌寄生菌，尤其對哈茨木霉（ 的菌寄生過程中涉及的酶類及其基因研究最多。 3菌寄生生化機理 菌寄生是一個連續(xù)的過程，一般認為菌寄生過程分為四步：趨向性生長、識別、接觸穿透和營養(yǎng)獲得（ 1987）。 向性生長 趨向性生長是指菌寄生菌由于受某些化學物質(zhì)的刺激而向性生長，從而到達寄主菌所在的位置（ 1987），它對菌寄生有促進作用，但這并不是菌寄生所必需的一步。 認為趨向性生長與寄主菌絲產(chǎn)生的化學刺激物的濃度梯度的方向有關(guān)（ 1983； et 1986）。吸器性活 體營養(yǎng)菌寄生菌的芽管對寄主的細胞表現(xiàn)強烈的正趨向性，菌寄生菌孢子萌發(fā)和芽管向性生長都需要一種或多種專門物質(zhì)的刺激作用，這些物質(zhì)可以由寄主菌物的分泌物提供。接觸性活體營養(yǎng)菌寄生菌與寄主菌物接觸前也表現(xiàn)有趨向性， 1973）報道 齒梗孢（ 膝葡孢（ 孢子萌發(fā)需要寄主菌絲的分泌物或酵母膏、玉米粉 、菌絲提取液等天然產(chǎn)物。但也有報道菌寄生過程中不存在趨向性生長，例如有 研究（ 1991）認為有些死體營養(yǎng) 菌寄生菌到達寄主菌物不存在向性生長，菌寄生菌到達寄主菌物的過程是隨機的。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 3 寄生菌與寄主菌的識別：凝集素和糖類的互作 識別是一種普遍而重要的生物現(xiàn)象。在菌物中，共棲、共生、寄生和致病等各種形式的相互關(guān)系都涉及到識別。 凝集素在菌寄生菌和寄主菌物相互識別中起重要作用。 1971）報道，利用與寄主真菌終極腐霉（ 絲直徑相當?shù)乃芰暇€替代終極腐霉菌絲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并不是簡單的接觸就能引發(fā)菌寄生行為的產(chǎn)生，菌寄 生真菌哈茨木霉（ T. 本不在塑料線周圍產(chǎn)生菌絲圈。他們的實驗說明在菌寄生真菌和寄主之間一定存在著某種識別機制。 1983 年， （ 1983）用哈茨木霉（ T. 鉤狀木霉（ T. 其寄主作為模式系統(tǒng)，首次證明寄主真菌立枯絲核菌（ 胞表面的凝集素在識別中起重要作用。 1985， 1990）通過研究哈茨木霉 (T. 和鉤狀木霉 (T. 與寄主真菌齊整小核菌（ 相互作用再次證明了寄主真菌細胞表面的凝集素在識別中的作用，并純化了這種凝集素。 該凝集素是一種糖蛋白，與蛋白酶和葡聚糖酶作用后凝集反應受到抑制，說明凝集素中的蛋白殘基和糖殘基參與凝集反應。 1992）將純化的齊整小核菌凝集素黏附到尼龍纖維上，哈茨木霉盤繞尼龍纖維并產(chǎn)生鉤狀體與在真的寄主菌絲上模式相似，進一步證明了凝集素在識別中的作用。 1993 年， 1993）正式提出菌寄生真菌與寄主真菌相互識別的凝集素 糖相互作用模型： 寄主真菌細胞表面的凝集素和寄生真菌細胞表面的糖分子的特異性接合，使寄主與寄生物達到相互識別。 寄生過程中的細胞壁降解酶 水解酶類在菌寄生過程中起著重要作用。 一方面它們參與菌寄生菌侵染寄主菌的過程，死體營養(yǎng)菌寄生菌產(chǎn)生細胞壁降解酶消解和殺死寄生真菌，從而獲得營養(yǎng)；吸器性活體營養(yǎng)菌寄生菌侵入寄主菌時，產(chǎn)生細胞壁降解酶，消解寄主菌細胞壁以助其侵入。另一方面菌寄生菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶又能對寄主菌孢子的萌發(fā)、芽管的伸長和菌絲的生長起到抑制作用（李多川， 1998）。 目前所報道的菌寄生真菌產(chǎn)生的細胞壁降解 酶類主要有幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和蛋白酶。 對它們的研究已有眾多報道，主要包括分離純化、基因克隆和基因表達（邢曉科， 2002）。 真菌的細胞壁主要是以幾丁質(zhì)為骨架，以 葡聚糖為填充物，其它還有少量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)（ 1967）。 真菌細胞壁包含大于 60的葡聚糖，幾丁質(zhì)以不規(guī)則的方式排列成層，葡聚糖以無定形的方式分布，幾丁質(zhì)和葡聚糖通過化學鍵形成由葡聚糖和 1979）。 因此幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶被認為是在降解真菌細胞壁過程中起重要作用。 有關(guān)其分離純 化和相關(guān)基因的克隆已多有報道。 由于純化的細胞壁降解酶對許多病原菌都是有效的殺菌劑，可以降解各種真菌組織如菌絲體、分生孢子及菌核等（ 1996； 2001），因此深入研究它 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 4 們在菌寄生過程中的作用，對生防菌的基因改良和農(nóng)作物抗病基因轉(zhuǎn)化有重要意義。 丁質(zhì)酶 菌寄生菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶分為 切幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，在侵染的不同部位和不同時期產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶也不盡相同。 1995）認為哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶 系由六種幾丁質(zhì)酶組成，即兩種 4氨基葡萄糖苷酶（ 四種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（ 幾丁質(zhì)酶是一種誘導酶，在含有幾丁質(zhì)或其部分水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性較高。 上述六種幾丁質(zhì)酶除 以葡萄糖為碳源胞外低水平表達的以外，其它都是以幾丁質(zhì)為唯一碳源時所誘導產(chǎn)生的。 近來在幾丁質(zhì)酶基因克隆和表達方面也做了許多研究。目前已知的菌寄生中的幾丁質(zhì)酶基因大多數(shù)都來自木霉，已被描述的木霉幾丁質(zhì)酶基因有： et 1995）、 et 1994；et 1994）、 et 1994）、 et 1995）、et 2001）、 et 1996）和 et 1993a）。1994 年 1994），首次在大腸桿菌中表達 隆，其產(chǎn)物具有幾丁質(zhì)酶活性。 被證實在對病原物的拮抗中起關(guān)鍵作用（ 1999）。 在以往的實驗中人們只在菌寄生的后期階段觀察到幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生 (et 1996)， et 1999）利用綠色熒光蛋白報告基因技術(shù)證明了內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因 表達發(fā)生在哈茨木霉與其寄主機械接觸之前，從而證明內(nèi)切幾丁質(zhì)酶 與菌寄生的前期過程。同時該實驗還證明了 表達 需要一種大于 12種大分子物質(zhì)是由 哈茨木霉 釋放的，擴散到達寄主真菌立枯絲核菌，使后者釋放一些細胞壁的低聚糖從而誘導 表達。 et 1998）將內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因 轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)對葉部病原菌細交鏈孢（ 立枯絲核菌 （ R. 和灰葡萄孢 (抗性。我國覃宏濤等（ 2000）把該基因轉(zhuǎn)入水稻，提高了對紋枯病的抗性。 聚糖酶 葡聚糖酶是以葡聚糖為底物 ,降解產(chǎn)生葡萄糖的一類水解酶。分為外切和內(nèi)切酶， 外切酶從末端連續(xù)切割葡萄糖殘基形成唯一的產(chǎn)物葡萄糖單體，內(nèi)切酶在隨機位點切割多糖鏈形成小的寡糖，只有在兩種酶共同存在時葡聚糖才能被完全消化 ( 975; 962; 966)。 菌寄生菌產(chǎn)生的葡聚糖酶在菌寄生中的作用已得到證明。哈茨木霉 株的內(nèi)切子量為 78灰葡萄孢（ 的孢子萌發(fā)和芽管伸長有強烈的抑制作用。 哈茨木霉 株的一種內(nèi)切 子量為43多種植物病原菌的生長有抑制作用。 （ 2000）認為哈茨木霉中的 - 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 5 葡聚糖酶體系由至少 5 種不同的酶組成 ,它們在聚丙烯酰胺凝膠中移動的距離 30最大的葡聚糖酶 1,3 200 已被分離純化。 1995) 純化了由一種立枯絲核菌上的寄生菌 葡萄穗霉（ 分泌的子量約為 94 酶可以誘導立枯絲核菌菌絲頂端發(fā)生變化， 包括菌絲尖膨脹、破裂、細胞質(zhì)滲漏以及多隔膜的形成。 在基因研究方面，哈茨木霉已有 11 種 葡聚糖酶被描述，兩種編碼基因（編碼外切 和編碼內(nèi)切 克隆。 1999）發(fā)現(xiàn)菌寄生真菌白粉寄生孢（ 寄生過程中胞外外切 編碼基因 哈茨木霉的 同源性分別為 46%和 30%， 培養(yǎng)的后期表達， 其轉(zhuǎn)錄受到真菌細胞壁成分的誘導。 表達受到碳水平的調(diào)節(jié)。在含有多糖、真菌細胞壁或無碳源的培養(yǎng)基中 在高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中被抑制 (et 1993; 997) 。 而且，不同真菌細胞壁的誘導水平不同，哈茨木霉在不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的 (et 1995; et 1998) 。 白酶 目前，對于菌寄生真菌產(chǎn)生的蛋白酶的報道很少。 1989）發(fā)現(xiàn)哈茨木霉 (在穿透尖孢鐮刀菌 (菌絲細胞壁時，伴隨著幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的產(chǎn)生，一種蛋白質(zhì)水解酶呈上升狀態(tài)，當時推測有一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類似物在阻遏幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的產(chǎn)生，蛋白質(zhì)水解酶水解阻遏物從而產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶。 et 1993）等從哈茨木霉 株中分離出了這種絲氨酸蛋白酶（ 并證明它在菌寄生過程中起協(xié)同作用，并已將這種絲氨酸蛋白酶基因克隆。 H (1998)發(fā)現(xiàn)哈茨木霉和寄主相互作用過程中產(chǎn)生一種堿性蛋白酶，并構(gòu)建了過量表達此酶的轉(zhuǎn)化菌株。 et (1997) 通過增加 蛋白酶基因 化菌株穩(wěn)定并攜帶 2 10個 哈茨木霉和立枯絲核菌在體外培養(yǎng)相互作用時， 因得到高水平表達。 細胞壁降解酶在菌 寄生中的作用機制是多因子事件。多數(shù)學者認為細胞壁降解酶在消解和穿透寄主菌物細胞壁過程中起直接作用。 但 研究表明，一些菌寄生菌對寄主菌物的消解和穿透與其產(chǎn)生的細胞壁降解酶不成正比。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 6 (1992) 認為菌寄生菌消解和穿透寄主菌物的過程既有酶的作用，也有機械壓力。同時，許多報道表明一些細胞壁降解酶在菌寄生過程中需要其它物質(zhì)協(xié)同作用。 et 1993b)發(fā)現(xiàn)哈茨木酶產(chǎn)生的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和殼二糖酶共同作用時的抑菌效果明顯，純化后單獨 作用抑菌效果都會降低。在其它一些真菌中也有報道表明幾種酶的混合液比純化的酶液的抑菌率高。 et 1988)和 1988)的研究證明高等植物中的葡聚糖酶類和幾丁質(zhì)酶類協(xié)同作用的抗菌性遠遠高于這些酶類的單獨作用。 et 1993）發(fā)現(xiàn)在 相互作用中幾丁質(zhì)酶和膠霉毒素表現(xiàn)協(xié)同作用。因此 細胞壁降解酶在菌寄生中的作用還需進一步研究。 真菌和線蟲都是植物病害的重要病原物，對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。由于 人們長期依賴化學農(nóng)藥，嚴重破壞了生態(tài)環(huán)境?；瘜W農(nóng)藥對環(huán)境的污染，對人類健康的威脅，病原物抗藥性的產(chǎn)生及對有益生物的危害已經(jīng)受到人們的高度重視。利用菌物防治植物病害具有無污染、持效長等優(yōu)點，是發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的一條重要途徑。 食線蟲真菌是一類廣泛分布于土壤和有機殘體上的寶貴資源，對線蟲的群體數(shù)量具有重要調(diào)控作用（ 987），同時一些食線蟲真菌也能寄生植物病原真菌。 1978 年， 首次發(fā)現(xiàn)捕食線蟲真菌的菌寄生現(xiàn)象。 以后 1985）和 1993）發(fā)現(xiàn)少孢節(jié)叢孢（ 寄生過程中的菌環(huán)、菌網(wǎng)中蛋白酶的活性顯著高于普通菌絲而在捕食線蟲的菌網(wǎng)中未見蛋白酶活性的提高，表明少孢節(jié)叢孢（ 線蟲的捕食和菌寄生具有不同機理。 盡管人為條件下捕食線蟲真菌的菌寄生現(xiàn)象已發(fā)現(xiàn)二十余年，但在自然條件下捕食真菌的菌寄生行為一直沒有發(fā)現(xiàn)。本實驗室李世東等在對我國菌核病菌寄生菌資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)自然土壤中許多菌核病菌的寄生菌為捕食線蟲真菌，進一步接種證明了這些菌類的菌寄生和捕食線蟲特性（李世東 等， 2000）。其中 發(fā)現(xiàn)的一新種，根據(jù)其捕食線蟲和寄生菌核雙重特性被定名為兩棲單頂孢（ （ D et 2003）。 本實驗以兩棲單頂孢為供試菌株，研究食線蟲真菌菌寄生現(xiàn)象的生化酶學機理，明確菌寄生過程中的相關(guān)酶類及其作用，為開發(fā)防病殺線多功能真菌生防制劑提供基礎(chǔ)。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 7 第二章 菌寄生過程中相關(guān)酶的篩選 材料與方法 一、材料 （一）供試菌株 菌寄生菌：兩棲單頂孢（ 85本實驗室提供。 病原菌：核盤菌（ 由本實驗室提供。 （二）試劑 幾丁質(zhì) 昆布多糖 塊狀茯苓 3， 5對二甲氨基苯甲醛 （三）供試培養(yǎng)基（ g/L） 1. 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基： 馬鈴薯 200，葡萄糖 20 瓊脂 15 2種子培養(yǎng)基： 葡萄糖 5，蛋白胨 5，酵母浸膏粉 5， 3膠體幾丁質(zhì)瓊脂培養(yǎng)基： 膠體幾丁質(zhì) 瓊脂 20， , 膠體幾丁質(zhì) 4葡聚糖瓊脂培養(yǎng)基： 葡萄糖 1，茯苓粉 4，瓊脂 20， ， ，苯胺藍 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 8 5誘導液體培養(yǎng)基： 1) 膠體幾丁質(zhì) 1， 2) 菌核粉 10， (， 3) 幾丁質(zhì)粉 10， (， 4) 蛋白胨 母膏 核 10， 5) 蛋白胨 母膏 丁質(zhì)粉 10， 6) 幾丁質(zhì)粉 2, 馬鈴薯 200, 蔗糖 5, 酵母浸膏 5， 7) 菌核粉 10， ， ， 。 8) 幾丁質(zhì)粉 10， ， ， 。 9) 粉狀幾丁質(zhì) 5, 菌核粉 5， ， ， 。 10）菌核粉 10， ， 11）幾丁質(zhì)粉 10， ， 12）馬鈴薯 200，蔗糖 10，酵母浸膏 5，菌核粉 2。 13）馬鈴薯 200，蔗糖 10，酵母浸膏 5，幾丁質(zhì)粉 2。 14）菌核粉 10， 15）幾丁質(zhì)粉 10， 16） 麩皮 10， (， 1， 17） 他命 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 9 二、方法 （一） 直徑 9培養(yǎng)皿內(nèi)倒入適量 養(yǎng)基，25恒溫培養(yǎng)，并觀察兩菌落的互作。 （二）平板透明圈法檢測酶活性 直徑 9培養(yǎng)皿內(nèi)倒入適量 幾丁質(zhì)瓊脂培養(yǎng)基， 中央接種兩棲單頂孢菌菌塊， 25恒溫培養(yǎng)，并觀察菌落周圍出現(xiàn)透明圈的情況。幾丁質(zhì)瓊脂平板呈乳白色，在幾丁質(zhì)酶水解作用下，幾丁質(zhì)可被水解成可溶性小分子使水解部位的平板變的無色透明，根據(jù)有無透明圈 及透明圈的大小可粗略判斷幾丁質(zhì)酶的有無及其活性大小。 直徑 9培養(yǎng)皿內(nèi)倒入葡聚糖 瓊脂培養(yǎng)基，中央 接種兩棲單頂孢菌菌塊， 25恒溫培養(yǎng)，并觀察菌落周圍顏色的變化。茯苓粉中的 在 1,3藍色消失，平板上表現(xiàn)為無色的水解區(qū)。由此可以判斷葡聚糖酶的產(chǎn)生情況。 （三）比色法測定酶活性 1酶液的制備 取供試液體培養(yǎng)基 50入 250角瓶內(nèi)滅菌后用無菌移液管接入 3子液。28 180蕩培養(yǎng)。 取培養(yǎng)液， 4 80000 分鐘取上清液即為粗酶液。 2 幾丁質(zhì)酶活性測定 膠體幾丁質(zhì)的制備（周樂聰， 2000）： 20g 幾丁質(zhì)細粉（過 60 目篩）溶解在 3004預冷）中，緩慢加熱到 37（一定不能升高溫度），同時用玻璃棒輕輕攪動，并將溫度維持在 37，待幾丁質(zhì)完全溶解后停止加熱。 4下放置 24 小時，用玻璃棉過濾到 2000乙醇中（ 4預冷）攪拌，待呈膠體狀， 10000棄上清。沉淀物用水反復漂洗至中性，再離心去除水分，重新懸浮于少量蒸餾水中。取 5體幾丁質(zhì)在 105 烘箱中烘干至恒重測出幾丁質(zhì)含量，加水調(diào)至幾丁質(zhì)含量為 1%。最后將幾丁質(zhì)膠體密封于玻璃杯中于 4冷藏備用。 試劑配制 ：稱取 8g 對二甲氨基苯甲醛 溶于 70醋酸和 10鹽酸的混合液中即為 1體積 9體積冰醋酸即為 1%配即用）。 配制 0、 5、 25、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 225、 250mg/l 濃度的 各濃度標準液 +100保溫 7卻后加入 2%7保溫 1585測 立標準曲線。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 兩棲單頂孢菌 （ 菌寄生性的酶學機理研究 10 測定步驟：取 1%膠體幾丁質(zhì)加入 勻， 37保溫 2100000 %蝸牛酶， 37保溫 30入 和硼砂溶液， 100保溫 7卻，加入 2%37保溫 1585測定 從 準曲線求得 氨基葡萄糖的 含量計算酶活力 ，以緩沖液代替底物為對照。每毫升酶液每小生時產(chǎn) 1 個酶活力單位。 試劑配制：稱取 20布多糖加 酸緩沖液溶解定溶至 50布多糖溶液；稱取 301g 3,5水溶解定容至 100 葡萄糖標準曲線的制備：配制濃度分別為 0， 50， 100， 200， 300， 400， 500， 600，700， 800mg/l 的葡萄糖標準液，取各濃 度標準液 1入 1液沸水浴 5卻，加入 5餾水混合均勻后 540測 ，建立標準曲線。 測定步驟：在試管中加入 昆布多糖， 50 預熱 5 50 準確反應 10 加入 液 ,沸水浴 5 止反應。冷卻 , 加 5 餾水混勻，在 540比色。測定 從葡萄糖標準曲線求得葡萄糖含量，計算酶活力。反應體系直接顯色為對照。每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生 1g 葡萄糖的量定義為 1 個酶活單位。 4蛋白 酶活性測定 試劑配制：酪蛋白 20g 加入 10水浴中攪拌使其溶解，加入 液 390容至 1000成 2%酪蛋白（當天配用或置于冰箱中儲存）；稱取 氯乙酸溶于蒸餾水，定容至 1000為 取 水 于蒸餾水，定容至 1000為 酪氨酸標準曲線的制備：將酪氨酸配成 0、 10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60mg/l 的7 個濃度每濃度取 1 入 劑 1水浴保溫 2060 。 測定步驟：取待測酶樣 1對照立即加入 2酶失活）加入 2%酪蛋白迅速混勻放入 40 水浴 10加入 止反