密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 小麥抗白粉病近等基因系 庫(kù)構(gòu)建 及抗病相關(guān)基因的全長(zhǎng) 隆 of of I 摘要 白粉?。?是影響我國(guó)小麥生產(chǎn)的主要病害之一。實(shí)踐證明，培育抗病品種是控制小麥白粉病的經(jīng)濟(jì)有效途徑。本實(shí)驗(yàn)室培育的小麥抗白粉病近等基因系（ *北京 837 因，該基因?qū)ξ覈?guó)目前白粉病主要流行小種表現(xiàn)高抗至免疫。對(duì) 因及其抗白粉病相關(guān)基因進(jìn)行克隆研究不僅有利于闡明抗病機(jī)制，而且對(duì)小麥抗白粉病研究具有重要價(jià)值。本研究以 庫(kù)為基礎(chǔ)，以測(cè)序?yàn)橹骶€，結(jié)合生物信息學(xué)方法和術(shù)對(duì)獲得的目標(biāo)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析，以期獲得抗病相關(guān)基因 。 以小麥抗白粉病近等基因系（ *北京 837材料， 在接種后 1 小時(shí)、 3 小時(shí)、 6小時(shí)、 9 小時(shí)、 12 小時(shí)、 16 小時(shí)、 20 小時(shí)、 24 小時(shí)剪取葉片，構(gòu)建了不同時(shí)間點(diǎn)混合的 白粉病菌誘導(dǎo)早期的小麥葉片 庫(kù) 。 文庫(kù)初始滴度為 06組率 96%，用包裝后的原始文庫(kù)直接轉(zhuǎn)化寄主菌 化效率為 90%以上，插入片段主要分布在 均大小為 900右。 通過(guò)隨機(jī)測(cè)序，獲得了 216 條質(zhì)量好的 列。利用 序?qū)@得的 216條 列與 據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源 分析 ，并將兩種比較結(jié)果進(jìn)行匯總， 獲得的結(jié)果如下： 102 條序列與 13 類功能已知基因同源性很高； 42 條序列與功能未知基因同源性很高；其余 72 條序列中 58 條可找到同源的 列， 14 條序列在 未檢索到任何同源序列。在配準(zhǔn)已知基因的 102 條 列中， 33 條序列與 30 種假定的抗病相關(guān)基因同源性很高。這些假定的抗病相關(guān)基因包含于抗病反應(yīng)的全過(guò)程，包括起識(shí)別病原菌作用的 R 基因、 小G 蛋白類基因、離子通道成分、 參與信號(hào)傳導(dǎo)的激酶、調(diào)節(jié) 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、過(guò)敏反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白、參與防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白、參與細(xì) 胞壁代謝的蛋白、與基礎(chǔ)防御和非寄主抗性有關(guān)的蛋白、在抗病過(guò)程中與細(xì)胞自我保衛(wèi)相關(guān)的蛋白以及與病原菌互作的寄主因子。 選擇 9 條假定的抗病相關(guān)基因，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行了序列特征分析，根據(jù)它們的序列設(shè)計(jì)引物，采用 術(shù)，研究了它們?cè)诓煌鞴僖约敖臃N白粉 病菌后的表達(dá)情況。小麥鈣依賴性蛋白激酶類基因 長(zhǎng) 1172有一個(gè) 876完整 碼291 個(gè)氨基酸，具有 構(gòu)域和 4 個(gè)手性區(qū)。它比所有配準(zhǔn)的 少 13 個(gè)氨基酸殘基。小麥 因 長(zhǎng) 1120有一個(gè) 378 碼 125 個(gè)氨基酸，與水稻蛋白激酶 前體同源性很高。這兩個(gè)基因 對(duì)病原菌誘導(dǎo)有應(yīng)答作用，可能參與了抗病反應(yīng)過(guò)程，它們的表達(dá)模式和表達(dá)量在抗感材料間存在顯著差異。在 24 小時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)，其它7個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本的積累沒(méi)有明顯的變化。 器官表達(dá)分析表明：鈣依賴性蛋白激酶類基因 因、 基因以及 基因 在不同器官間轉(zhuǎn)錄本積累水平不同。 根據(jù)獲得的假定的 富含甘氨酸蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，在 5 個(gè)不同的小麥基因組 進(jìn) 行擴(kuò)增，在 白粉 病近等基因系中得到 一條約 5不同于其它 4 個(gè)材料的擴(kuò)增帶。 通過(guò) 電子拼接和 術(shù)，獲得一個(gè)小麥中尚未報(bào)道的小 G 蛋白基因 全長(zhǎng)列。 因擬編碼的蛋白具有結(jié)合 4 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域以及 族成員所特有的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域分析表明： 個(gè)結(jié)構(gòu)域在小麥材料間非常保守，而 構(gòu)域的 A 氨基酸殘基及其鄰近的 C 端 6 個(gè)氨基酸殘基在材料間存在著很大差異。基因表達(dá)表明： 因的表達(dá)不受白粉病菌誘導(dǎo)。 關(guān)鍵詞： 小麥，白粉病， 庫(kù)，抗病相關(guān)基因，基因表達(dá) is of to is is of In to of , 3, 6, 9, 12, 16, 20 4 A of 066%. 0%. of .4 kb .0 of .9 216 on as 102 3 of 42 to 58 14 no 02 33 0 to in of in by in to in 3 to 9 on to in to 172 bp an 76 bp 91 by 3 120 bp an 78 bp 25 of by in in of no at on of in a of to NA A 00bp of a ab A of of by to 錄 第一章 緒論 1 1 1 長(zhǎng) 隆策略 1 物功能基因組學(xué)研究 6 物抗病性研究進(jìn)展 10 麥抗白粉病相關(guān)基因研究進(jìn)展 21 究?jī)?nèi)容和方法 23 第二章 白粉病菌誘導(dǎo)早期小麥葉片 庫(kù)構(gòu)建及序列分析 25 25 料與處理 25 法 25 32 度與質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 32 擴(kuò)增 庫(kù)的滴度與重組率 32 化效率 32 列的產(chǎn)生 33 分析結(jié)果 33 分析結(jié)果 33 35 35 庫(kù)的載體選擇 35 于基因功能的劃分 35 病信號(hào)傳導(dǎo)途徑 36 庫(kù)測(cè)序獲取目標(biāo)序列的可行性 37 第三章 小麥抗病相關(guān)基因全長(zhǎng) 列鑒定及表達(dá)分析 39 39 料 39 法 39 42 小麥鈣依賴性蛋白激酶類基因 序列鑒定及表達(dá)特性分析 42 麥?zhǔn)荏w類蛋白激酶基因 序列鑒定及表達(dá)特性分析 47 麥 因的序列鑒定及表達(dá)特性分析 50 麥 基因（ 序列鑒定及表達(dá)特性分析 52 麥富含甘氨酸蛋白 （ 因 序列鑒定及表達(dá)特性分析 54 麥 族 轉(zhuǎn)錄因子（ 的序列鑒定及表達(dá)特性分析 57 麥 可溶性 序列鑒定及表達(dá)特性分析 59 V 麥類質(zhì)子泵基因（ 的序列鑒定及表達(dá)特性分析 61 麥 絲氨酸 因 (序列鑒定及表達(dá)特性分析 64 論 66 抗白粉病有關(guān)的小麥類 因 66 粉病菌誘導(dǎo)增強(qiáng)的小麥類鈣依賴性蛋白激酶基因 67 麥 錄因子基因（ 68 氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶基因分析 68 麥富含甘氨酸蛋白 （ 因（ 69 麥 因（ 69 麥 質(zhì)子泵基因（ 69 麥 可溶性 69 第四章 基于電子延伸技術(shù)的小麥小 70 料與方法 70 料與處理 70 取 70 子延伸的基本過(guò)程 70 源性比較 71 白的多序列比較 71 增 71 增片段克隆及測(cè)序 71 因的 定量檢測(cè) 72 73 列拼接結(jié)果 73 麥 因 長(zhǎng)的分離 73 導(dǎo)的小麥 白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析及同源性比較 74 麥 白結(jié)構(gòu)域的保守性分析 75 因的表達(dá)分析 75 76 于電子拼接 76 于 76 參考文獻(xiàn) 79 致謝 93 附錄 94 作者簡(jiǎn)歷 114 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 究目的和意義 白粉病是影響我國(guó)小麥生產(chǎn)的主要病害之一，隨著施肥、灌溉條件的改善和半矮桿品種的推廣應(yīng)用，其危害有擴(kuò)大和逐年加重的趨勢(shì)，抗病育種形式非常嚴(yán)峻。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)所農(nóng) 業(yè)部作物種質(zhì)資源與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以北京 837 作輪回親本，經(jīng)過(guò)多年回交和自交成功地獲得了含 因的抗白粉病近等基因系。 因 對(duì)我國(guó)目前白粉病主要流行小種表現(xiàn)高抗至免疫。 對(duì) 因及相關(guān)防衛(wèi)基因的克隆研究不僅有利于闡明其抗病機(jī)制，而且對(duì)實(shí)施農(nóng)作物基因工程高效育種具有重大意義。 庫(kù)是真核生物 群的 貝集合，是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因結(jié)構(gòu)及功能的基礎(chǔ)工具，該技術(shù)已成為當(dāng)今研究真核分子生物學(xué)的基本手段。以往人們構(gòu)建的小麥白粉病菌誘導(dǎo)的 庫(kù)，取樣時(shí)間點(diǎn)都比較偏后，這樣很難 捕捉到抗病反應(yīng)途徑中的早期反應(yīng)基因或節(jié)點(diǎn)基因。大多數(shù)植物抗病基因?yàn)榻M成型表達(dá)（ et 1997），但也有誘導(dǎo)表達(dá)的，如 et 1996)。即使是組成型表達(dá)，在病菌的誘導(dǎo)下，表達(dá)量可能會(huì)有低水平的增強(qiáng)。 因是否為誘導(dǎo)表達(dá)目前還不清楚。本研究的主要目的是通過(guò)構(gòu)建白粉病菌誘導(dǎo)早期 小麥葉片 庫(kù) ， 采用隨機(jī)測(cè)序策略 ， 并結(jié)合生物信息學(xué)方法和 以期獲得 與 白粉病抗 性有關(guān) 基因。 內(nèi)外研 究現(xiàn)狀 長(zhǎng) 隆策略 在人類基因組計(jì)劃的帶動(dòng)下，擬南芥 (et 1999, et 1999)、水稻 (et 2002, et 2002)等植物基因組的序列草圖相繼完成，給人類提出了新的挑戰(zhàn)：如何鑒定這些序列的功能及解析生命現(xiàn)象的本質(zhì)，這是一個(gè)更加龐大而復(fù)雜的課題，正促使一門新的學(xué)科即功能基因組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展。功能基因組學(xué)研究的內(nèi)容非常廣泛，但是認(rèn)識(shí)基因功能的基本前提是獲取可能有相關(guān)功能的基因全長(zhǎng)編碼序列。其中全長(zhǎng) 列的獲得是正確地注釋基因組序列、闡明基因功能和產(chǎn)物的必要條件 (et 2003)。 目前獲得全長(zhǎng) 隆的分子生物學(xué)技術(shù)有三種，即 庫(kù)篩選法、以 基礎(chǔ)的 端快速擴(kuò)增法（ of 及基于生物信息學(xué)的硅片克隆技術(shù)（ in 現(xiàn)就上述三種方法分述如下 ： 庫(kù)篩選法（ 或大量測(cè)序技術(shù)） 該技術(shù)的核心是構(gòu)建高質(zhì)量的 庫(kù)。 庫(kù)是真核生物 群的 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 貝集合，它只代表一定時(shí)期正在表達(dá)的 15%左右的基因 ,因此 隆的復(fù)雜程度比直接從基因組克隆要小得多，而且由于每個(gè) 隆只代表一種 列 ,因此在基因克隆過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率比較低。 庫(kù)具有多方面的用途。首先，可以從 庫(kù)中獲得全長(zhǎng)基因。在已知基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或部分氨基酸序列后，可以根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)一段簡(jiǎn)并寡核苷酸作探針，從相應(yīng) 庫(kù)中篩選到該基因的全長(zhǎng) 可以用已獲得的該基因的部分核苷酸序列作探針，從相應(yīng) 庫(kù)中篩選到該基因的全長(zhǎng) 次 庫(kù)來(lái)源于基因表達(dá)產(chǎn)物，基因在染色體上大多數(shù)為單、低拷貝，位置數(shù)目有限，因此是很好的 次，從 庫(kù)中獲得的基因序列已不含有內(nèi)含子和邊側(cè)調(diào)控序列，與其對(duì)應(yīng)的基因組序列相比較，可以弄清基因的結(jié)構(gòu)。另外，通過(guò)對(duì) 庫(kù)的大量測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)新基因和了解生物體內(nèi)基因含量及某基因的表達(dá)豐度。 于克隆和大量擴(kuò)增，不象基因組內(nèi)含子難于表達(dá)，從 庫(kù)篩選到所需目的基因后，可直接用于該目的基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因研究，在基因工程研究中，真核細(xì)胞的 庫(kù)往往比基 因組文庫(kù)更為有用。因此， 庫(kù)的構(gòu)建成為當(dāng)前真核生物分子生物學(xué)研究和基因工程操作的基礎(chǔ)。 經(jīng)典的 庫(kù)建立方法是用 逆轉(zhuǎn)錄引物，也有用隨機(jī)引物的，然后給合成的 上適當(dāng)?shù)倪B接結(jié)構(gòu)，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中而構(gòu)成。這種建庫(kù)方法實(shí)用、高效、簡(jiǎn)單方便。但最大的缺點(diǎn)是文庫(kù)中克隆片段的長(zhǎng)度一般較小，一般需若干個(gè)克隆才能覆蓋一個(gè)完整的 ao et 1996； Yu et 1997)，用經(jīng)典的 成方法得到的產(chǎn)量通常不高，造成這種低效率的主要原因是目前構(gòu)建 庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)方案里，從 板出發(fā)到最后合成雙鏈 段，需經(jīng)過(guò)多步的體外酶學(xué)反應(yīng)，由于無(wú)法做到在每步酶學(xué)反應(yīng)結(jié)束后純化出反應(yīng)產(chǎn)物以進(jìn)行下一步酶學(xué)反應(yīng)，所以只能采取折中方法，將所有的酶學(xué)反應(yīng)都放在一個(gè)經(jīng)優(yōu)化的基礎(chǔ)緩沖條件下進(jìn)行，這種優(yōu)化的反應(yīng)條件不是各種酶催化活性發(fā)揮所需的最佳條件，因此反應(yīng)效率自然不會(huì)高。 為了更加有效地克隆新的基因 ,如何克服僅由 )尾合成 術(shù)路線的局限性 ,以及由逆轉(zhuǎn)錄酶作用特點(diǎn)導(dǎo)致的局限性 ,建立富含全長(zhǎng) 文庫(kù)就顯得非常有意義。為了避免 為 一鏈合成的引物造成的 截現(xiàn)象，人們對(duì)第一鏈引物末端的兩個(gè)堿基作了改進(jìn)（ 中 V 可以是 A、 C 或 G， N 則為 A、 T、 C、 G 中的任意一種堿基，這就避免了由于 部存在寡聚（ T）而造成的 應(yīng)于 3端出現(xiàn)的短截現(xiàn)象。傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄酶 都不能逆轉(zhuǎn)錄出很長(zhǎng)的 推出 ,使逆轉(zhuǎn)錄出更長(zhǎng)的 為可能。 (et 2000)研究表明一些糖類如海藻糖能有效提高反轉(zhuǎn)錄酶和 其它一些酶類的活性，并能提高酶的最適反應(yīng)溫度，從而為打破 二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高反轉(zhuǎn)錄的效率提供了可能。 真核生物的 原核生物不同，其 5端有一個(gè)特殊的甲基化帽子結(jié)構(gòu)， 5端帽子結(jié)構(gòu)就成為人們構(gòu)建全長(zhǎng) 庫(kù)，尋找突破口的主要目標(biāo)。全長(zhǎng) 庫(kù)的構(gòu)建方法都是基于 5端帽子結(jié)構(gòu)的特殊性研究出來(lái)的。其中代表性的方法有： et 1997；et 1994)、 (et 1995)、 (Y.Y et 2001)、 et 1996)、 et 1999）。 此方法又叫做寡聚核糖核酸單鏈連接法（ 1994 年， 人首先取得了突破。他們利用 5帽子的結(jié)構(gòu)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 特點(diǎn) ,用細(xì)菌堿性磷酸酶 (除無(wú) 5端保護(hù)的、部分降解的、不完整 端的游離磷酸基團(tuán) ，再用煙草酸性磷酸酶 (除 5的 構(gòu)僅保留一個(gè) 5P，合成一段寡核糖核酸，用 接酶連接到經(jīng)過(guò)處理的 的 5后利用修飾的 逆轉(zhuǎn)錄 ,并進(jìn)行 應(yīng) ,稱為 方法的優(yōu)點(diǎn)在于為反轉(zhuǎn)錄第一鏈 到全長(zhǎng)設(shè)定了標(biāo)準(zhǔn)，從而有利于全長(zhǎng) 富集。理論上由于利用了 術(shù)會(huì)導(dǎo)致基因的拷貝數(shù)得到極大的擴(kuò)增，從而利用極少量的起 始材料就可以建庫(kù)。該方法存在的不足有以下四點(diǎn)： 應(yīng)的效率比理論上的大大降低，所以需要的起 始材料非常大。 及 應(yīng)在模板的量和長(zhǎng)度上的選擇性，所以會(huì)導(dǎo)致在文庫(kù)中某種類型的克隆的富集，因此，不能真實(shí)地反映組織中各種基因的存在情況，同時(shí)會(huì)在以后的測(cè)序反應(yīng)中產(chǎn)生冗余性。 板長(zhǎng)時(shí)間的暴露在酶反應(yīng)中會(huì)使降解的風(fēng)險(xiǎn)性加大，不利于得到高質(zhì)量的庫(kù)。 接酶，一般來(lái)講 接酶沒(méi)有 接酶的效率高，所以連接效率的高低也會(huì)直接影響到文庫(kù)的質(zhì)量。 （ 1995）報(bào) 道了一種稱為 方法 ,據(jù)稱能夠非常有效地建立全長(zhǎng)的 庫(kù)。他們利用 帽結(jié)合蛋白 專門結(jié)合 帽結(jié)構(gòu) ,含有完整帽子結(jié)構(gòu)的富集 , 逆轉(zhuǎn)錄后用 用于 合子 ， 未被帽結(jié)合蛋白結(jié)合的 部分降解 的不完整 有一些雖結(jié)合了 帽結(jié)合蛋白 但 不完整的 被降解 , 僅完整 有全長(zhǎng) 一鏈結(jié)合保護(hù)的那些 保護(hù) ， 進(jìn)一步純化富集后建庫(kù) ,獲得的克隆全長(zhǎng)比例很高 ,但每次需極其大量的 00 另外 ， 被帽結(jié)合蛋白結(jié)合的 端約 10 50丟失。所以嚴(yán)格來(lái)講所謂的全長(zhǎng) 庫(kù)并不是全長(zhǎng)的。此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是 ：特異地對(duì) 5帽子進(jìn)行篩選，目的性更強(qiáng)；整個(gè)過(guò)程對(duì) 酶促反應(yīng)較少，降低了 利于得到全長(zhǎng)的 隆，從而使文庫(kù)中全長(zhǎng)的比例很高；不進(jìn)行 因的冗余性大大降低。此技術(shù)的缺點(diǎn)是效率和產(chǎn)量很低，需要的起始材料的量非常大 ,不利于有限材料的建庫(kù)；模板 端的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)帽結(jié)合蛋白的有效性有著非常大的影響，從而會(huì)導(dǎo)致某一種類型 的 富集，使文庫(kù)的克隆產(chǎn)生偏向性；被帽結(jié)合蛋白結(jié)合的末端約 10堿基被丟失，不利于分析。 （ 司推出的試劑盒 又命名為 是利用帽子結(jié)構(gòu)特征 ,充分利用了反轉(zhuǎn)錄酶 T 末端轉(zhuǎn)移酶活性和限制性內(nèi)切酶 特性。 T 是轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過(guò)點(diǎn) 突變而得來(lái)的，它喪失了 性，但仍然保留著野生