分 類 號 學號 2005615400092 學校代碼 10487 密級 碩士學位論文 慢病毒轉(zhuǎn)染 細胞治療類風濕性關(guān)節(jié)炎 大鼠疼痛的療效評價 學位申請人： 蔣煥偉 學 科 專 業(yè) ： 麻醉學 指 導 教 師 ： 羅愛林 教授 答 辯 日 期 ： 2009 年 4 月 A of of of of in F B by : 30030, P. R. 2009獨創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明，本學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果的總結(jié)。盡我所知，除文中已經(jīng)標明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本人將承擔本聲明引起的一切法律后果。 學位論文作者簽名： 日期： 年 月 日 學位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版，允許論 文被查閱和借閱。本人授權(quán)華中科技大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。 保密 ，在 _年解密后適用本授權(quán)書。 本論文屬于 不保密。 （請在以上方框內(nèi)打“” ） 學位論文作者簽名： 指導教師簽名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 目 錄 中文摘要 錯誤 !未定義書簽。 2 正 文 前 言 2 1 材料與方法 5 2 結(jié)果 10 3 討 論 錯誤 !未定義書簽。 參考文獻 17 綜 述 21 附錄 發(fā)表文章 39 致 謝 40 華中科技大學碩士學位論 文 1 慢病毒轉(zhuǎn)染 的 細胞治療類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠疼痛的療效評價 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院麻醉學教研室 碩士研究生 ： 蔣煥偉 指 導 老 師 ： 羅愛林 教授 中文摘要 目的 慢病毒轉(zhuǎn)染的 細胞靜脈注入類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠，評價 其 治療效果 。 方法 雌性 6只 ，隨機分為 2組 :對照組 和治療組 ， 每組 8只 。 治療組大鼠靜脈注射 攜帶 細胞，對照組靜脈注射未 轉(zhuǎn)染 的 細胞。 于 注射前兩周 開始每 兩 周一次觀察 測定踝關(guān)節(jié)輻射熱痛閾、 機械刺激 50%縮爪閾值 、 血清類風濕因子 （ 、腫瘤壞死因子 (的 水平。于 第 56天 處死大鼠，光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織病理學結(jié)構(gòu) ，取脾臟分選出單個核細胞后檢測 結(jié)果 與對照組比較，治 療組大鼠踝關(guān)節(jié)輻射熱痛閾降低（ P、血清 平 下降 （ P。 與對照組比較，治療組 大鼠踝關(guān)節(jié)組織切片顯示關(guān)節(jié)滑膜增生、骨和軟骨破壞、大量炎癥細胞滲出等典型關(guān)節(jié)炎改變 明顯減輕 。 治療組 脾臟檢測到 對照組 未發(fā)現(xiàn) ，兩組均未檢測到 結(jié)論 慢病毒轉(zhuǎn)染的 細胞靜脈注入類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠后能降低疼痛閾值，減輕關(guān)節(jié)病理改變，減少類風濕因子的產(chǎn)生，誘導脾臟 關(guān)鍵詞 關(guān)節(jié)炎 ； 類風濕；模型 ； 細胞 ； 慢病毒 華中科技大學碩士學位論 文 2 of of in F B by To F B by to to n=8 I I In F B by in F B by of 50% of of (, On to of to h1 h2 In of of in of of in h1 of in in h2 in F B by of 華中科技大學碩士學位論 文 3 of of h1 in 華中科技大學碩士學位論 文 4 前 言 類風濕性關(guān)節(jié)炎（ 發(fā)病率高達世界人口的 1，其關(guān)節(jié)慢性疼痛及功能障礙嚴重地影響了眾多患者的生活質(zhì)量 1。目前認為， 由于關(guān)節(jié)滑膜炎性反應損傷關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)囊，進而導致疼痛和功能障礙的一 類自身免疫性疾病，自身免疫性T 輔助細胞和 B 細胞均在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，然而確切的機制尚不清楚 2正因如此，類風濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)治療方法以及近來發(fā)展的使用抑制或殺傷 T 淋巴細胞或 B 淋巴細胞的治療方法 2雖可取得不同程度的療效，卻均存在選擇性低、特異性不強、副作用大等問題，限制了它們在臨床上的應用。 顯然，探索新的更安全有效、副作用低的治療方法，滿足 療的迫切需要，必須對 病機制進行更深入的研究 。 本研究旨在通過構(gòu)建強力霉素誘導 達的慢病毒，轉(zhuǎn)染 細胞，誘導巴細胞 的凋亡，通過 巴細胞的減少，抑制 胞和 B 細胞的相互作用，從而對類風濕性關(guān)節(jié)炎慢性疼痛進行有效靶向治療。 華中科技大學碩士學位論 文 5 1 材料與方法 物選擇 及分組 6只， 6 8 周，體重 170 190 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。 隨機 分成兩組 ，治療組和對照組 （ n 8） 。在 制作模型前一天（ 實驗前（ 0W）、注射慢病毒 轉(zhuǎn)染的 細胞 后 2W，分別檢測血清行機械性痛覺超敏測定和 輻射熱痛 測定。 劑 及儀器 大鼠免疫球蛋白 口分裝試劑盒）以及 位檢測 試劑盒均購自武漢 博士德生物有限公司， 口分裝試劑盒） 和 進口分裝試劑盒）購自晶美公司， 足底觸覺測量儀 (37400型 )為意大利 輻射熱測痛儀 (為 中國科學院生物醫(yī)學工程公司 產(chǎn)品 ， 流式細胞儀 為 美國 品 。 療關(guān)節(jié)疼痛 慢病毒 轉(zhuǎn)染的 細胞 注射方法為 ： 實驗組 大鼠 尾靜脈 注射 染的細胞（細胞數(shù)約 1 107） ，每 2周注射一次，連續(xù) 3次，在注射慢病毒 轉(zhuǎn)染的 細胞 后 第 6天 開始 喂食 濃度為 1mg/導 對照組注射未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的 細胞，其余步驟相同。 鼠免疫球蛋白 (1). 洗滌液：濃縮洗滌液于 37孵育 20分鐘。濃縮洗滌液與蒸餾水 1： 20倍稀釋使用。 (2). 底物工作液配置：顯色前 5分鐘將 片加底物稀釋液 5 (3). 標 準品配置：使用前每瓶標準品中加入蒸餾水 200 (4). 實驗前 30分鐘取出試劑盒，以平衡至室溫。 (5). 取出所需板條，剩余密封放回 4冷藏。 華中科技大學碩士學位論 文 6 (6). 建立標準曲線：設(shè)標準孔 8孔，每孔各加入樣品稀釋液 100 l，第一孔加入標準品 100 l，混勻后用加樣器吸出 100 l，移加入第二孔，如此反復對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出 100 之體積均為 100 l、第八孔為空白對照。 (7). 加樣 ： 待測樣品孔中每孔加入待測樣品 10 l，加入樣品稀釋液至 100 l。 (8). 將反應板充分混勻后置 37 60分鐘。 (9). 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌 5次，向濾紙上印干。 (10). 每孔加入酶標抗體工作液 100 l。 (11). 將反應板充分混勻后置 37 60分鐘。 (12). 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌 5次，向濾紙上印干。 (13). 每孔加入底物工作液 100 l，置 37暗處反應 10分鐘。 (14). 每孔加入 50 (15). 使用 酶標儀， 檢測樣本 490 械性痛覺超敏測定 將實驗大鼠置于 態(tài)足底觸覺測量儀的樹脂玻璃籠（ 10 1015，網(wǎng)籠置于鐵絲網(wǎng)板上以便實驗操作和觀察。實驗前適應環(huán)境 15試者手持 下向上垂直刺激后足底皮膚表面（避開不敏感的肉墊），呈對數(shù)增強的力度（ 8.0 5.0 g），持續(xù) 10s，每次測定間隔 10性反應定義為大鼠對刺激快速縮爪，試驗從 一個陽性反應發(fā)生時，下一 個刺激低于本次力度；若一個陰性反應發(fā)生時，下一個刺激高于本次力度，第一次反應發(fā)生后再連續(xù)觀察 5次，記錄實驗結(jié)果，并轉(zhuǎn)換為 50%的縮爪閾值 7 機械縮爪閾值測定：于 細胞 注射后 2周、 4周和 6周使用足底觸覺測量儀采用 9 測定機械縮爪閾值，以 50縮爪閾值（ 50 50% 示：大鼠置于觀測籠內(nèi)，待其安靜后，用足底觸覺測量儀從觀測籠下方垂直于術(shù)側(cè)后爪外側(cè)皮膚給予一系列機械刺激（ 每個刺激持續(xù) 6 8s，每兩個刺激間隔至少2察大鼠的反應。出現(xiàn)縮足反應為陽性，反之為陰性，每兩次刺激間隔 2分鐘。 華中科技大學碩士學位論 文 7 從 2 呈陽性反應則選擇下移一個刺激級別 (g)，若呈陰性反應則選擇上移一個刺激級別 (g)，依次類推。當出現(xiàn)相鄰兩次反應不一致 （ 陽性反應變?yōu)殛幮苑磻蜿幮苑磻優(yōu)殛栃苑磻r，繼續(xù)依序刺激 4次，連同這兩次一共 6次刺激結(jié)果用于計算機械刺激的 50%縮爪閾值如下： 50 0)+次刺激中陽性反應與陰性反應次數(shù)的比值。是各相鄰級別刺激力度對數(shù)值之差的平均數(shù)，此處 需選擇的刺激力度超過 15.1 g，則50縮爪閾值直接記為 15.1 g。 射熱痛 測定 使用 大鼠置于玻璃板上，使用熱輻射儀照射其后趾相應的部位，記錄從照射到縮爪反應的時間，即縮爪潛伏期。在實驗前均先測定足底基礎(chǔ)痛閾值，測量同一部位時，每次間隔 5 使其痛覺恢復正常，每只大鼠左右 足底各測試 3次，縮爪時間 平均值 即為其痛閾值 。 察關(guān)節(jié)病理組織學 于注射后第 56天將大鼠斷頸處死，切下病變踝關(guān)節(jié)，浸泡于 10中性甲醛液固定，硝酸脫鈣液脫鈣，浸蠟、包埋、 4伊紅蘇木素（ 色，顯微鏡下觀察。 操作步驟 如下 ： (1). 從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其它板條請密封放回 4。 (2). 除空白孔外，分別將標本或不同濃度標準品 (100 l/孔 )加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔， 37孵箱孵育 90分鐘。 (3). 洗 板 4次。 (4). 除空白孔外，加入生物素化抗體工作液 (100 l/孔 )。用封板膠紙封住反應孔，37孵箱孵育 60分鐘。 (5). 洗板 3次。 (6). 除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液 (100 l/孔 )。 封板膠紙封住反應孔， 37 華中科技大學碩士學位論 文 8 孵箱孵育 30分鐘。 (7). 洗板 3次。 (8). 加入顯色劑 100 l/孔，避光 37孵箱孵育 10 (9). 加入終止液 100 l/孔 ,混勻后即刻測量 5分鐘內(nèi) )。 根據(jù)檢測標準品樣本 算出相應的濃度，繪制出標準曲線，然 后根據(jù)標準曲線，計算出樣本 胞凋亡檢測 淋巴細胞分離液分選出脾臟單個核 細胞，取各組細胞分別和 多 克隆抗體 04 孵育 1h， 入 羊 抗 驢 二抗 4 孵育 次，用 00l，經(jīng) 式細胞儀檢測細胞凋亡。 亡過程中細胞核 原理是；生物素（ 記的 作用下 ,可以連接到凋亡細胞中斷裂的 可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（ 異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（ 存在下，產(chǎn)生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在普通顯微鏡下即可觀察和計數(shù)凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 而沒有 3少能夠被染 色。 操作步驟 如下： (1). 培養(yǎng)細胞的預處理： 在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸，干燥后在去離子水中漂洗，干燥后 4保存； 淋巴細胞分離液分選出脾臟單個核 細胞， 各組離心收集約 1106個細胞， 懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細胞很好的吸附到載玻片上； 華中科技大學碩士學位論 文 9 將吸附細胞的載玻片在 4%多聚甲醛中固定 25 次 5 將吸附細胞的載玻片在 次 5 (2). 上述處理好的細胞涂片，用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加 100 溫平衡 5 10 (3) 時配置 冰上保存待用； (4). 用濾紙小心吸去樣本區(qū)域周圍的多余液體，滴加 100 (5). 在反應區(qū)域蓋上蓋玻片以確保反應液分布均勻，于 37 、潮濕環(huán)境中反應60 (6). 去除蓋 玻片，在反應樣本區(qū)域加入 100 l 2溫放置15 (7). 次 5 (8). 5 (9). 次 5 (10). 滴加 100 溫反應 3 5 (11). 次 5 (12). 于載玻片的樣本區(qū)域滴加 100 l 到呈現(xiàn) 深 棕色背景； (13). 用去離子水漂洗 2 3次； (14). 用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加幾滴甘油于樣本區(qū)域，然后蓋上蓋玻片進行封片，即可在光學顯微鏡下進行觀察并拍照。 計學處理 采用 量資料以均數(shù)標準差（ s）表示，組內(nèi) 采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析 ，組間比較采用單因素方差分析， 率的顯著性檢驗采 華中科技大學碩士學位論 文 10 用 2檢驗 ， P 2 結(jié)果 清 對照組血清 g/g/療組為（ g/g/療后 差異有統(tǒng)計學意義 (P 治療后 異無統(tǒng)計學意義 (P見圖 1。 02468 2 4 6)ug/ 大鼠血清 清 對照組血清 g/g/療組為 (g/g/療后 差異有統(tǒng)計學意 華中科技大學碩士學位論 文 11 義 (P 治療后 異無統(tǒng)計學意義 (P 見圖 2。 051015202530 2 4 6)ug/ 大鼠血清 清 對 照組血清 483 86)pg/492 87)pg/療組為(258 67)pg/277 66)pg/療后 差異有統(tǒng)計學意義 (P治療后 異無統(tǒng)計學意義 (P 見圖 3。 華中科技大學碩士學位論 文 12 0100200300400500600700 2 4 6)pg/ 大鼠血清 0縮爪閾值 在 40縮爪閾值分別是（ g，治療組分別是（ g，治療后 50縮爪閾值顯著升高， 差異有統(tǒng)計學意義 (P 治療后輻射 熱痛域 值比較制作模型前有所升高，差異有統(tǒng)計學意義 (P 見圖 4。 華中科技大學碩士學位論 文 13 051015202530 2 4 6)50%g) 大鼠 50縮爪閾值 射熱痛域值測定 在 4痛域 值分別是 (s，治療組分別是(s，治療后輻射 熱痛域 值有升高，差異有 統(tǒng)計學意義 (P；治療后輻射 熱痛域 值比較制作模型前有所升高，差異有統(tǒng)計學意義 (P 見圖 5。 華中科技大學碩士學位論 文 14 051015202530 2 4 6) 大鼠輻射熱痛域值 鼠踝關(guān)節(jié)組織切片 于 第 56天 處死大鼠，光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織病理學結(jié)構(gòu) 。 光鏡下見 對照組 大鼠 踝關(guān)節(jié)組織滑膜組織增生，呈乳頭狀突向關(guān)節(jié)腔；滑膜細胞增生、排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤，有血管翳形成。嚴重者骨破壞向邊緣侵蝕并伴有軟骨破壞。關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性細胞滲出（見圖 6）。 治療組 大鼠上述 病變減輕 。 華中科技大學碩士學位論 文 15 對照組 治療組 圖 6大鼠踝關(guān)節(jié)組織切片（ 200） 式細 胞儀檢測脾臟 于 第 56天 處死大鼠， 分選出脾臟單個核細胞后，檢測 對照組 、 治療 組和的凋亡率分別是 (和 (%（圖 7）， 與對照組相比，治療組凋亡率增加， 兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（ P ， 結(jié)果說明 細胞治療 能夠促進 對照組 治療組 圖 7 流式細胞儀檢測各組 于 第 56天 處死大鼠， 分選出脾臟單個核細胞后，檢測淋巴細胞凋亡， 對照 組和治療 組的凋亡指數(shù)分別為 (%和 (%（圖 8），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（ P 結(jié)果進一步說明 細胞治療 能夠促進 華中科技大學碩士學位論 文 16 對照組 治療組 圖 8 200） 3 討論 在過去的幾十年里，人們一直認為在類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中起著十分重要作用的巨噬細胞和 13近來隨著 來越多的證據(jù)表明 15。 16。 細胞本身 17。 18。 最新研究表明，自身免疫性 19和 細胞在類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。 類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制和 20。在器官特異性自身免疫性疾病中，異常增多的 重病情 21 細胞有密切關(guān)系 ：其一，類風濕因子特異性 以激活大量自身免疫性 24，導致異常細胞免疫損傷關(guān)節(jié)；其二， 細胞功能，而正常人體不存在活 化類風濕因子特異性 細胞 25所以類風濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)大量異常 細胞。綜上所述，自身免疫性 細胞具有相互活化的緊密關(guān)系，均在類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制 華中科技大學碩士學位論 文 17 中起著重要作用，可望作為治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的良好靶點。 如何使異常增多的 持 29，從而對相關(guān)疾病進行治療 ,是解決問題的關(guān)鍵。 本實驗制作大鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎慢性疼痛模型，分選 細胞，構(gòu)建強力霉素誘導 染 細胞后 ，靜脈注入類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：靜脈注射轉(zhuǎn)染的 細胞后，最大關(guān)節(jié)炎評分降低，大鼠踝關(guān)節(jié)輻射熱痛閾升高，血清 節(jié)炎癥改變明顯減輕，脾臟 些實驗證實強力霉素誘導 F 制 細胞活化，減少類風濕因子產(chǎn)生。本研究使用 細胞作為靶向細胞，克服了目前不能分辯自身免疫性 用自身免疫性 F 妙地定向誘導自身免疫性 到治療類風 濕性關(guān)節(jié)炎的作用。這一研究表明自身免疫性 F 治療自身免疫性疾病提供了一新的靶點。 參考文獻 1 S. of 2003, 423: 356 2 , , , et of of 2001, 31: 1603 S. in J 2004, 114: 4714 R, W, W, et of in J 1994, 53: 555 J, . 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