福建農(nóng)林大學碩士學位論文 生防菌 毒素活性物質(zhì)分析 及對香蕉枯萎病誘導抗性的研究 學 科 門 類：農(nóng)學 一級學科名稱：植物保護 二級學科名稱：農(nóng)藥學 研 究 方 向：生物農(nóng)藥 論 文 編 號 ： 完 成 時 間：二 00九年四月 he of of to 2009 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學位（畢業(yè)）論文，是本人在指導教師的指導下獨立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對本研究做出貢獻的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔應(yīng)有的責任。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學有關(guān)保留、使用學位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學校有權(quán)送交論文的復印件，允許 論文被查閱和借閱 ; 學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬于不保密。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導教師親筆簽名： 日期： 2006 級福建農(nóng)林大學碩士學位論文 目 錄 中文摘要 . I 英文摘要 . 一章 文獻綜述 . 1 前言 . 1 1 生防細菌種類及其在病害防治中的應(yīng)用概況 . 1 2. 生防細菌抗菌機制 . 2 爭和定殖作用 . 2 寄生作用 . 2 進植物生長 . 2 抗作用 . 2 導植物抗病性 . 3 3 微生物源抗真菌物質(zhì)的研究進展 . 3 制細胞膜合成 . 3 制細胞壁合成 . 3 制蛋白質(zhì)合成 . 4 制電子傳遞，影響能量系統(tǒng) . 4 制核酸合成 . 4 . 5 學物質(zhì)對植物抗病性誘導的研究 . 5 物因子對植物抗病性誘導的研究 . 6 5 本研究的意義 . 7 第二章 生防菌 脂肪酸生物標記指紋圖譜及粗毒素抑菌活性 的初步研究 . 8 前言 . 8 1 材料和方法 . 8 驗材料 . 8 防菌 脂肪酸生物標記指紋圖譜測定 . 8 防菌 長曲線的測定 . 9 防菌 毒素的制備及抑菌譜的測定 . 9 原菌孢子懸浮液的制備 . 9 防菌 毒素對指示菌的生物活性測定 . 9 2 結(jié)果與分析 . 10 防菌 脂肪酸生物標記指紋圖譜 . 10 防菌 生長曲線與生防菌粗毒素采樣時間 . 10 防菌 毒素拮抗病原菌的生測結(jié)果 . 11 防菌 毒素對指示菌的活性測定 . 11 3 討論 . 14 第三章 生防菌 菌活性物質(zhì)的研究 . 16 2006 級福建農(nóng)林大學碩士學位論文 前言 . 16 1 材料與方法 . 16 驗材料 . 16 外蛋白的分析 . 16 外多糖的分析 . 17 2 結(jié)果分析 . 18 外蛋白的分析結(jié)果 . 18 外多糖的分析結(jié)果 . 20 3 討論 . 22 第四章 生防菌 株對香蕉組培苗相關(guān)酶活性的影響 . 23 前言 . 23 1 材料與方法 . 23 驗材料 . 23 株對香蕉組培苗侵染條件的研究 . 23 液的提取及酶活測定方法 . 23 2 結(jié)果分析 . 25 防菌 株對香蕉組培苗侵染的結(jié)果 . 25 防菌 多酚氧化酶（ 性的影響 . 25 防菌 過氧化物酶（ 性的影響 . 26 防菌 超氧化物歧化酶（ 性的影響 . 27 防菌 丙二醛（ 量的影響 . 28 3 討論 . 29 第五章 生防菌 株對香蕉枯萎病誘導抗性的研究 . 31 前言 . 31 1 材料與方法 . 31 驗材料 . 31 液提取和酶活測定方法 (同第四章試驗方法 )。 . 31 . 31 香蕉枯萎病菌對香蕉組培苗多酚氧化酶（ 性的影響 . 31 香蕉枯萎病菌對香蕉組培苗過氧化物酶（ 性的影響 . 33 香蕉枯萎病菌對香蕉組培苗超氧化物歧化酶（ 性的影響 . 34 香蕉枯萎病菌對香蕉組培苗丙二醛（ 量的影響 . 35 . 36 參考文獻 . 38 附錄一 . 43 附錄二 . 44 附錄三 固態(tài)硫酸銨法分級分離 . 45 個人簡歷 . 46 致 謝 . 48 2006 級福建農(nóng)林大學碩士學位論文 i 中文摘要 (1) 生防菌短短芽孢桿菌 (本實驗室從土壤中分離得到一株芽孢桿菌菌株，經(jīng)中科院及實驗室的脂肪酸鑒定儀鑒定其為短短芽孢桿菌，研究發(fā)現(xiàn)其對枯萎病原菌，青枯菌均具有一定的拮杭作用，而且能夠分泌抗菌物質(zhì)到發(fā)酵液中。測定了短短芽孢桿菌 (生長曲線；對其粗毒素性質(zhì)進行考察，結(jié)果表明：在 30 ， 170 r/條件下，恒溫振蕩培養(yǎng) 48 h，在以香蕉枯萎病菌病原菌作為指示菌的條件下，該菌株粗毒素具有一定的熱穩(wěn)定性；其粗毒素抑菌作用的最適 為 和 ，仍能維持較高的抑菌活性；此粗毒素對光照、蛋白酶 K、紫外照射均不敏感。 (2) 經(jīng)硫酸銨沉淀后粗毒素基本失去活性。采用 80%的無水乙醇對粗毒素進行處理，實驗結(jié)果表明：上清和沉淀溶解液均對香蕉枯萎病菌具有抑菌活性，但是在 100 水浴 0.5 h 后，沉淀失去活性。而上清的活性基本沒有變。這說明粗毒素中至少存在兩種活性物質(zhì)。采用光譜掃描、 手段對處理液進行了研究。對 外多糖采用柱層析、薄層層析及紅外光譜等方法，確定其組成分。 用 進行分離，皆出現(xiàn)明顯單峰；分子量為 04 含有羧酸、吡喃單體，但無乙酰酯 。 (3)研究了 果表明：在30 ， 12 2 且延遲了 部 變化不明顯。莖部和葉片 且 片根部莖部。 (4) 設(shè)置了不同處理對其誘導抗性進行了研究。在香蕉組培苗上接種香蕉枯萎病病菌和 定 活性及 量變化。結(jié)果表明：接種 株發(fā)酵液處理的性明顯高于其他處理，對其活性誘導分別在 6 d、 4 d 以后但是病原菌首先對 生影響，所有處理對植株根莖的 性與對照相比無明顯變化，但是單獨接種香蕉枯萎病 菌的處理使葉片的性明顯提高；接種病原菌和生防菌均使植株 量有不同程度的升高，但是同時接種兩種菌的處理使植株的 變化較小。因此，經(jīng)處理后對于植株的利弊有待于進一步研究。 關(guān)鍵詞 : 短短芽孢桿菌；抗菌物質(zhì)；誘導抗性 2006 級福建農(nóng)林大學碩士學位論文 文摘要 (1) by by of it . f. to 6 h 0 , 170 r/to a of h at It 0 . pH of At .0 It a to , (2) of by 0% f. 00 .5 h in a of at of of to of it is 04 Da - (3) of s In 0 , 12 h 2 h be PO OD K, POs s in ODs of K. K, DA in of (4) We up in to s, s PO,s DA d, 4d OD of of K no OD of f. DA in at of to be 006 級福建農(nóng)林大學碩士學位論文 1 第一章 文獻綜述 前言 生物防治是利用有益微生物殺滅或降低病原生物的數(shù)量以控制植物病害發(fā)生、發(fā)展的一類措施 1。它的實質(zhì)就是利用生物種間關(guān)系、種內(nèi)關(guān)系，調(diào)節(jié)有害生物種群密度，即生物群防治生物群。生物防治包含 3 個方面的策略或方法： 1)調(diào)節(jié)病原物種群，用生物控制因子將病原物種群數(shù)量控制在一個允許的閾值水平以下； 2)保護性排除方法，以有益微生物通過位點營養(yǎng)競爭作障礙，排除病原物侵染 ； 3)自身防御，以寄主植物抗性預防或抑制病害發(fā)生，如誘導抗性 2。 近幾十年來，植物病蟲害生物防治研究發(fā)展迅速，它的應(yīng)用日益受到農(nóng)業(yè)和環(huán)保的重視。而植物病蟲害的微生物防治是植物病蟲害生物防治的一條重要途徑，微生物農(nóng)藥的研制、開發(fā)與商品化正在迅速發(fā)展。而生防菌在生產(chǎn)實踐的應(yīng)用受到生防菌自身的特點，接種方式，環(huán)境條件等諸多因素的影響。生防菌抑病機理研究以及生防菌代謝物活性物質(zhì)的分析是實際應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。 1 生防細菌種類及其在病害防治中的應(yīng)用概況 生物防治技術(shù)在我國有著悠久的歷史，詩經(jīng)中 螟蛉有子，蜾嬴負之 的詩句，表明兩千多年前古代人對生物互相制約現(xiàn)象的認識。但把生物防治作為近代科學研究是從 20 世紀 30 年代開始的。微生物農(nóng)藥的研制和商品化生產(chǎn)以蘇云金桿菌最為突出， 劑是生物農(nóng)藥研究領(lǐng)域中實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)化的一個主導產(chǎn)品。生防菌的種類繁多，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用 的有真菌、細菌、放線菌、病毒等。 細菌因其龐大的種類和數(shù)量、高速的繁殖力、復雜的代謝活動、對病原物的作用方式多樣、又易于人工培養(yǎng)等特點，在自然發(fā)生的生物防治和人類應(yīng)用生物防治的活動中，拮抗細菌及其代謝產(chǎn)物都起到了重要的作用 3。目前應(yīng)用較多的生防細菌主要 有芽孢桿菌 (、假單胞桿菌 ()、土壤放射桿菌 ( 4。 芽孢桿菌是目前生防細菌研究較多的一類 5，因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和 抗 有機溶劑的內(nèi)生孢子，具有抑制植物病害的能力，又是自然界中廣泛存在的非致病細菌 。 對人畜無害，不污染環(huán)境，因而備受各國研究工作者的青睞，是篩選生防菌很好的對象 6。用于生防芽孢桿菌的種類有枯草芽孢桿菌 (B 蠟狀芽孢桿菌 (B 巨 大芽孢桿菌 (B. 多粘芽孢桿菌 (B 地衣芽孢桿菌 (B. 短 短 芽孢桿菌 (B 7。應(yīng)用芽孢桿菌可防治的植物病害有馬鈴薯瘡痂病、 蘋果紅腐病、 番茄青枯病、小麥赤霉病以及其他一些土傳和地上病害 4。國外利用枯草芽孢桿菌 (B 治由水稻紋枯病菌 (腐霉菌 (、鐮刀菌 (引起的病害，取得較好的效果 8；澳大利亞開發(fā) 的枯草芽孢桿菌 麥類和胡蘿卜立枯病以及其他土傳性病害具有很好的防治和增產(chǎn)作用 9。國內(nèi)利用枯草芽孢桿菌防治蘋果輪紋病，取得了較好的效果 10；對桃和油桃褐腐病的抑制效果顯著 11；對西瓜枯萎病菌大、小分生孢子的萌發(fā)及芽管的生長均有明顯的抑制作用 12。此外，多粘類芽孢桿菌對灰霉病菌有較強拮抗活性和定殖能力，并誘導番茄植株對灰霉病產(chǎn)生系統(tǒng)抗性 13。短 短 芽孢桿菌對蘋果斑點落葉病有較好的防效 14，能抑制草莓灰霉病菌的生長以及對小麥根腐病有強抗生作用 15。 假單胞桿菌 (大量存在于植物的根圍和葉圍 。 土壤中是以不同生物型的熒光假單胞桿菌 (P. 主，目前應(yīng)用的主要種類有熒光假單胞桿菌 (P. 惡臭假單胞菌 ( P. 洋蔥假單胞桿菌 (P. 4。其中熒光假單孢桿菌 (是報道最多、在防治2006 級福建農(nóng)林大學碩士學位論文 2 土傳病害方面應(yīng)用效果較好的一類生防菌，對馬鈴薯、黃瓜、甜菜、豌豆、胡蘿卜、小麥等常見 的 土傳病害如猝倒病、枯萎病、軟腐病、小麥全蝕病等 均 有不同程度的防 治效果，且該菌附著在植物根際兼有對病原菌的拮抗作用和對根際主要微生物直接或間接作用的綜合效果 16。何禮遠等人 利 用熒光假單胞菌株對花生種子浸泡接種，對土壤中青枯菌的侵染具有明顯保護能力。樓兵干等 人 發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌(理種子時，能有效防治由腐霉 (和茄絲核菌 (起的黃瓜和番茄的苗期猝倒病 17。 放射性土壤農(nóng)桿菌 (作為生防因子成 功應(yīng)用的首例是 人 在澳大利亞使用放射性土壤農(nóng)桿菌 株防治由根癌土壤桿菌 (A. 起的果樹冠癭病和預防根癌腫病18。近年來，我國分離出對葡萄根癌病有顯著防效的土壤放射桿菌 大田試驗具有一定的防效 19。此外，曾有報道具有分泌幾丁質(zhì)能力的節(jié)桿菌 ()可用來防治由石竹尖鐮孢 (f. 起的香石萎蔫病和由小麥全蝕病菌 (致的小麥全蝕病 4。 用在植物病害生物防治中的放線菌主要是鏈霉菌屬 (及小單孢菌屬 (20主要防治一些常見的土傳病害病原菌，如腐霉菌 (、鐮刀菌 (、疫霉菌 (和絲核菌等 21。 在生防真菌開發(fā)應(yīng)用方面，迄今研究應(yīng)用較多的是木霉屬各種 ( 22。據(jù)不完全統(tǒng)計，木霉菌至少對 18 屬 29 種病原真菌表現(xiàn)拮 抗活性 23。拮抗木霉主要有哈茨木霉 (綠色木霉(鉤狀木霉 (T 長枝木霉 (康氏木霉 (以及新近歸為粘帚霉屬的綠粘帚霉 (目前已商業(yè)化的產(chǎn)品主要是哈茨木霉菌株及少量的綠色木霉菌株 24多數(shù)用于核盤菌屬 (疫霉屬、絲核菌、腐霉屬、鐮孢屬輪枝孢屬(所致土傳病害 的防治 25。 2. 生防細菌抗菌機制 爭和定殖作用 競爭作用即生防微生物通過對營養(yǎng)物質(zhì)的爭奪、物理和生物學位點的搶奪等方式控制植物病原微生物的發(fā)展。在作物根表存在著一些適合細菌生長和繁殖的有利位點，有益微生物搶先占領(lǐng)這些位點，有效地利用根圍營養(yǎng)和分泌物，減少病原菌所需的營養(yǎng)物質(zhì) ;或者占據(jù)了生態(tài)位點，阻止和降低了有害菌在這些位點的建立。競爭作用是生防微生物發(fā)揮作用的重要機制之一，涉及生防微生物在植物根際或體表或體內(nèi)的定殖、繁殖與種群的建立及與病原微生物的相互作用。競爭方式有空間競爭、營養(yǎng)競爭 26。 關(guān)于定殖的定義國內(nèi)外不同研究者具有不同的概念，但是定殖都應(yīng)包括以下幾個方面：一是能夠在植物根際生存下來，二是能以植物根際作為生防菌本身適合的環(huán)境而繁殖，隨著植物根系的發(fā)達而龐大，通過與其它生物競爭而形成一個較大的群體 27。 寄生作用 由水解酶介導的重寄生是生防菌的作用機制之一 28。植物病原高等真菌的細胞壁是以幾丁質(zhì)為骨架，以 于生長過程中的菌絲尖端幾丁質(zhì)多呈裸露狀態(tài)。易被水解酶所攻擊而導致 細胞破裂，生長受阻或者細胞死亡，阻止病害的發(fā)生發(fā)展 26。 進植物生長 1993 年報道植物根際的鏈霉菌具有固氮作用，可與植物形成共生關(guān)系，促進植物的生長。弗蘭克氏菌共生固氮放線菌能夠誘導大范圍的放線菌根瘤植物產(chǎn)生根瘤，并促進植物對 元素的吸收。從而也增強了植物對環(huán)境脅迫的抗性 26。 抗作用 拮抗作用是生防微生物防治植物病害的一個重要機制。拮抗微生