密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 瓜枝孢弱毒菌株誘導(dǎo)黃瓜抗病性 與致弱 機(jī)理研究 on of on of on of on of I 摘 要 本論文對(duì)瓜枝孢（ 毒菌株的弱致病性、誘導(dǎo)抗病性及其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，從瓜枝孢弱毒菌株形態(tài)特征變化、細(xì)胞壁降解酶活性變化、可溶性蛋白變化等方面初步闡明了瓜枝孢弱毒菌株的致弱機(jī)理。 1、瓜枝孢弱毒菌株可以誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生對(duì)黑星病的抗病性，并且這些特性可以穩(wěn)定遺傳。 在一致的溫度、濕度環(huán)境條件下，誘導(dǎo)接種濃度、挑戰(zhàn)接種濃度以及誘導(dǎo)遲滯期對(duì)黃瓜誘導(dǎo)抗病性作用均有影響：在相同挑戰(zhàn)接種濃度和表達(dá)時(shí)期時(shí)，誘抗效果隨著弱毒菌株誘導(dǎo)濃度的提高而明顯增強(qiáng)；在相同誘導(dǎo)接種濃度和表達(dá)時(shí)期時(shí)，誘抗效果隨著挑戰(zhàn)接種 濃度的提高而迅速遞減；在相同誘導(dǎo)接種濃度和挑戰(zhàn)接種濃度時(shí)，抗病性表達(dá)有遲滯期，在誘導(dǎo)后 48h 抗病效果最高。 通過繼代培養(yǎng)證實(shí)，瓜枝孢弱毒菌株的弱致病性、誘導(dǎo)抗病性都能夠連續(xù) 9代穩(wěn)定遺傳。 2、瓜枝孢弱毒菌株較強(qiáng)毒菌株相比，孢子形態(tài)變小，致病酶活性降低、可溶性蛋白帶明顯減少。 分析 瓜枝孢弱毒菌株 毒力減弱機(jī) 理 ，證明 瓜枝孢弱毒菌株 無論是離體外還是寄主 活 體內(nèi)，細(xì)胞壁降解酶（ 活性都要明顯低于其母本 強(qiáng)毒菌株。 并且在各個(gè)時(shí)期內(nèi)，弱毒菌株產(chǎn)生的酶活性變化幅度小，而強(qiáng)毒菌株在各個(gè)時(shí)期產(chǎn)生的酶活性差別 大，動(dòng)態(tài)變化顯著。 從可溶性蛋白電泳圖譜分析看出，強(qiáng)毒菌株間蛋白帶有明顯的相似性，弱毒菌株的可溶性蛋白帶明顯減少，并在 缺少一條蛋白帶。 關(guān)鍵詞： 瓜枝孢弱毒菌株；誘導(dǎo)抗病性；致弱機(jī)理 he is on of of of on of of of 1 of be by In or of in of of If of of be to h 2. to By of x) of in in in in in of f in in 錄 第一章 緒 論 . 1 1誘導(dǎo)抗病性現(xiàn)象 . 1 導(dǎo)抗病性 . 1 導(dǎo)抗病性影響因子 . 2 抗劑的獲得 . 2 2誘導(dǎo)抗病性機(jī)理 . 3 織病理學(xué)機(jī)理 . 3 理生化機(jī)制 . 4 子生物學(xué)機(jī)理 . 4 3本論文研究目的和意義 . 6 第二章 瓜枝孢弱毒菌株誘導(dǎo)黃瓜抗病性研究 . 7 1瓜枝孢弱毒菌株弱致病性研究 . 7 料與方法 . 7 果與分析 . 9 結(jié)與討論 . 10 . 11 料與方法 . 11 果與分析 . 13 結(jié)與討論 . 15 . 17 料與方法 . 17 果與分析 . 19 結(jié)與討論 . 22 . 23 料與方法 . 23 果與分析 . 25 結(jié)與討論 . 27 第三章 瓜枝孢弱毒菌株致弱機(jī)理研究 . 28 . 28 料與方法 . 28 果與分析 . 29 結(jié)與討論 . 31 . 32 料與方法 . 32 果與分析 . 34 結(jié)與討論 . 36 . 38 料與方法 . 38 果與分析 . 40 結(jié)與討論 . 41 第四章 全文結(jié)論 . 42 . 42 . 42 望 . 43 參考文獻(xiàn) . 44 致 謝 . 47 作 者 簡 歷 . 48 V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 烯酰胺 ,N,N 丙烯酰胺 ,N,N,N 叉 雙丙烯酰胺 瓜枝孢菌 羧甲基纖維素鈉 細(xì)胞壁降解酶 甲基纖維素酶 ,5,5磷酸鹽緩沖液 聚甲基半乳糖醛酸酶 膠甲基反式消除酶 二烷基 磺 酸鈉 十二烷基 磺 酸鈉 烯酰胺凝膠電泳 ,N,N,N N,N,N,N- 四 甲 基 二 乙胺 三羥甲基氨基甲烷 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 目前，植物誘導(dǎo)抗病性已成為植物病理學(xué)、微生物學(xué)、植物生理學(xué)乃至生物化學(xué)領(lǐng)域最活躍的研究分支之一。植物病理學(xué)家發(fā)現(xiàn)植物具有可激活的抗病免疫機(jī)制，現(xiàn)在已經(jīng)得到了有關(guān)專家的肯定，這也揭開了植物誘導(dǎo)抗病性研究的新篇章。這種抗病免疫性可以通過在植株局部接種，使整個(gè)植株獲得系統(tǒng)性抗病性，從而保護(hù)植株在整個(gè)生長期內(nèi)免受病害的侵襲。用弱毒菌系誘導(dǎo)抗性是改變寄主 、弱毒菌系都具有與植物發(fā)生前期互作的能力，但前者能把互作繼續(xù)發(fā)展為建立寄生關(guān)系并使其發(fā) 病，后者在給予寄主刺激后就停止互作向抗寄生關(guān)系方面發(fā)展，而這個(gè)刺激可以誘導(dǎo)植物的抗性。其基本思想是：把同種或近緣的弱毒菌系接種于寄主，使被保護(hù)的植物獲得對(duì)強(qiáng)毒菌系的抗性，又稱獲得性免疫。 早在 1901 年， 報(bào)道了可以用銹菌的弱毒小種感染小麥來抵抗銹菌的再次侵染。 1929） 首先在植物病毒病害上也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。 10 年后 1939）在真菌病害中也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象后，引起了植物病理學(xué)家的高度重視，誘導(dǎo)抗病性實(shí)現(xiàn)了植物不同部分的溝通，用生物的手段控制植物體內(nèi)的防衛(wèi)反應(yīng)，而且可誘導(dǎo)植 物產(chǎn)生普遍的抗性。隨著研究的進(jìn)展， 20 世紀(jì) 60 年代初 現(xiàn)用病毒誘導(dǎo)煙草、蠶豆、豇豆后，產(chǎn)生了抵抗病菌侵入的能力。 20 世紀(jì) 70 年代，科學(xué)家在瓜類作物的誘導(dǎo)抗病性中取得了很大進(jìn)展，用真菌、細(xì)菌或病毒局部侵染瓜類作物（即免疫化處理），可免遭多種真菌、細(xì)菌和病毒的危害。 8090 年代，人們又開始對(duì)誘導(dǎo)抗性的機(jī)制和應(yīng)用進(jìn)行了較為深入的研究。有些成果已經(jīng)在生產(chǎn)上開始推廣應(yīng)用，在日本用弱毒菌株 到的產(chǎn)品 護(hù)番茄免受病毒病的危害，瑞士生產(chǎn)的 防治植物的卷葉病等，為植物病害的防治開辟了一條新途徑。近些年來，這個(gè)領(lǐng)域的研究取得了可喜的成績和進(jìn)展，誘導(dǎo)免疫已成為控制植物病害的新策略。 1誘導(dǎo)抗病性現(xiàn)象 導(dǎo)抗病性 植物誘導(dǎo)抗病性的現(xiàn)象在二十世紀(jì)初就被發(fā)現(xiàn)，然而關(guān)于植物誘導(dǎo)抗病性的研究工作卻始于二十世紀(jì) 50 年代。最初人們把這種現(xiàn)象叫做獲得抗性（ 獲得性免疫（ 近幾年才正式使用誘導(dǎo)抗（?。┬裕?概念。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 誘導(dǎo)抗性是指利用物理的、化 學(xué)的以及生物的方法處理植物以改變病害反應(yīng)，使原來感病的植物產(chǎn)生局部的或系統(tǒng)的抗性。它分為局部誘導(dǎo)抗性和系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性。局部抗性（ 只在誘導(dǎo)部位周圍產(chǎn)生的抗性，其典型例子如過敏性壞死反應(yīng)（ 是通過侵染點(diǎn)周圍細(xì)胞的壞死而阻止病菌擴(kuò)展的現(xiàn)象。系統(tǒng)抗性（ 指誘導(dǎo)植物局部后植物全身都表現(xiàn)出抗病性。植物系統(tǒng)獲得抗病性是植物抵抗病原物侵染的一種主要特性，指植物經(jīng)病原菌或其弱毒株系誘導(dǎo)或接種 后、某些化學(xué)物質(zhì)處理，幾天內(nèi)被接種的植物產(chǎn)生新的、廣譜的系統(tǒng)抗性，從而對(duì)病原物再次侵染以及其他病菌的侵染均具有很強(qiáng)的抑制性，該抗病性可擴(kuò)展到整個(gè)植株。 導(dǎo)抗病性影響因子 導(dǎo)濃度（壓力或強(qiáng)度） 誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)免疫作用的效果之間有著直接的相關(guān)性，一般情況隨著誘導(dǎo)濃度的逐漸增加，免疫效果也逐漸提高，但達(dá)到一定濃度后，誘導(dǎo)效應(yīng)不再增強(qiáng)，趨于穩(wěn)定。如在番茄枯萎病誘導(dǎo)抗性研究中，番茄尖孢鐮刀菌（ 為誘導(dǎo)菌，當(dāng)它與挑戰(zhàn)菌同時(shí)接種時(shí)，它的接種量需要占絕對(duì)優(yōu)勢，才能產(chǎn)生理想的誘導(dǎo)效果。 導(dǎo)遲滯期 誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生需要在誘導(dǎo)處理和挑戰(zhàn)接種之間有一個(gè)時(shí)間間隔 遲滯期，它是植物對(duì)誘導(dǎo)刺激發(fā)生“免疫應(yīng)答”到防衛(wèi)基因表達(dá)和產(chǎn)物積累所需要的時(shí)間，在此遲滯期前進(jìn)行挑戰(zhàn)接種，植株將不表現(xiàn)或只表現(xiàn)較弱的誘導(dǎo)抗性。不同的誘導(dǎo)因子 病原物之間有不同的誘導(dǎo)遲滯期，即使同一系統(tǒng)中，表現(xiàn)局部誘導(dǎo)抗性或系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性所需的遲滯期也不一定相同。董漢松（ 1993）用煙草赤星病菌弱毒株 導(dǎo)煙草抗赤星病研究表明誘導(dǎo)抗性在誘導(dǎo)處理 6 天后開始表現(xiàn)。蔡新忠等（ 1999）用番茄葉霉菌小種（番茄 系的非 致病小種）誘導(dǎo)處理研究表明誘導(dǎo)局部抗性其遲滯期為 3d，而系統(tǒng)抗性大于 3d。不同誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)不同植物所需的誘導(dǎo)時(shí)間差別很大。如黃瓜幼苗經(jīng)短暫熱激后 3 小時(shí)即開始表現(xiàn)出對(duì) 抗性， 12h 后誘導(dǎo)的抗性水平達(dá)到最高限度。而用 誘導(dǎo)接種，則經(jīng)過 48始表現(xiàn)誘導(dǎo)抗性作用。 抗劑的獲得 誘抗劑（ 指能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)的物質(zhì)和因素。大量研究證明，能起到誘導(dǎo)抗病作用的誘導(dǎo)劑種類很多，包括生 物性的和非生物性的，生物誘抗劑主要有病原物的非親和小種（株系）、病原物的弱毒株系、病原物的近似種、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 病原物、病原物的處理物、生物性激發(fā)子、異種病原菌、無毒菌株、植物提取物、根際細(xì)菌（ 等。 非 生 物 誘 抗 劑 主 要 是 與 誘 導(dǎo) 抗 病 有 關(guān) 的 信 號(hào) 分 子 水 楊 酸（ 茉莉酸（ 乙烯等以及它們的結(jié)構(gòu)類似物和衍生物（徐建明， 2001；于讓才， 1996）， 另 外 還 有 寡 糖 類 誘 抗 劑 （ , 1984）、 硅 （ R,1995）等。 獲得誘抗劑的方法主要是從自然界篩選和人工改造，人工改造包括誘變， 熱處理，遺傳工程等方法。但是這些相關(guān)的研究大多還只局限于植物本身的反應(yīng)，而對(duì)于誘導(dǎo)劑特別是生物源誘導(dǎo)劑如何作用于植物而使其對(duì)病原菌產(chǎn)生免疫力的機(jī)制還沒有一個(gè)明確的認(rèn)識(shí)。 石 破 知 加 子 等 （ 1981） 用 從 葫 蘆 科 根 系 上 分 離 出 對(duì) 黃 瓜 幼 苗 不 致 病 的 理黃瓜下胚軸切口端，可誘導(dǎo)黃瓜真葉對(duì)炭疽病的抗性。 1965）將熱殺死的煙草野火病菌引進(jìn)煙葉葉片的間隔， 誘導(dǎo)了對(duì)隨后接種的野火病菌的抗性。高壓滅菌殺死的 孢子預(yù)處理咖啡葉，能誘導(dǎo)對(duì)病菌侵染的抗性（ ， 1997）。 1985 年日本專家后藤等從患病番茄上分離了具有減輕病癥效果的 星 其導(dǎo)入 病株上成功地獲得了弱毒株系。吳營昌等利用從黃瓜枯萎病病株上分離到的尖孢鐮刀茵的弱毒菌接種西瓜，用于誘導(dǎo)西瓜對(duì)枯萎病的抗性 （ 吳營昌， 1991） 。國際水稻所植病系遺傳室用紫外光誘變稻瘟病菌而得到的淺黃色素突變體是非致病菌株，對(duì)水稻抗稻瘟病有誘導(dǎo)抗病現(xiàn)象（ 沈瑛 ,1992）。王彰明等從小麥紋枯病病株上分離的小麥紋枯病菌 ( 帶菌小木段葉鞘嵌入法接種小麥，獲得較好的誘導(dǎo)抗病效果（王彰明， 2003）。 2誘導(dǎo)抗病性機(jī)理 使用非（弱）毒菌作為誘抗劑來處理植株可產(chǎn)生對(duì)病害的抗性是無可置疑的，但這種誘導(dǎo)抗性的機(jī)制還一直處在研究當(dāng)中。目前，對(duì)誘導(dǎo)抗性機(jī)理的認(rèn)識(shí)不斷深入，總體上認(rèn)為，免疫的機(jī)制是復(fù)雜的，并不是單一的。 織病理學(xué)機(jī)理 誘導(dǎo)抗性包含從植物細(xì)胞壁到細(xì)胞內(nèi)部的一系列結(jié)構(gòu)抗性反應(yīng)，使寄主形成阻止或抑制病菌侵染 或擴(kuò)散的結(jié)構(gòu) ,包括胼胝質(zhì)，凝膠，侵填體以及與細(xì)胞壁修飾有關(guān)的結(jié)構(gòu)特征。細(xì)胞壁修飾是指植物細(xì)胞受脅迫后細(xì)胞壁發(fā)生變化，包括產(chǎn)生乳突、細(xì)胞木質(zhì)化、積累富含羥脯氨酸的糖蛋白（ 外源凝集素等。細(xì)胞木質(zhì)化是被普遍接受的一種機(jī)制 , 研究證明，黃瓜植株中誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性與受侵染后寄主植物木質(zhì)化能力迅速增強(qiáng)有關(guān)（ A,1987）。細(xì)胞壁蛋白是普中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 遍存在植物細(xì)胞出生壁中的一類結(jié)構(gòu)蛋白，迄今已發(fā)現(xiàn) 4 種：富含羥脯氨酸蛋白（ 又稱伸展蛋白；富含甘氨酸蛋白（ 富含蘇氨酸和羥脯氨酸的糖 蛋白（ ；富含組氨酸和羥脯氨酸的糖蛋白（ 目前， 多的一類細(xì)胞蛋白。 充在纖維素構(gòu)成的細(xì)胞壁骨架中，不能被細(xì)菌分泌的纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶分解，起到了抵抗病菌侵染的屏障作用。 具有凝集作用，阻止病原菌侵入或在細(xì)胞間擴(kuò)散。 理生化機(jī)制 植物在受誘導(dǎo)后所發(fā)生的生理生化反應(yīng)有：可溶性碳水化合物和酚類物質(zhì)含量增加，植物保衛(wèi)素（ 稱植保素）產(chǎn)生和積累以及多種酶活性的變化、病程相關(guān)蛋白（ 產(chǎn)生等。 時(shí)葉片中酚類物質(zhì)沉積作用增強(qiáng)（ ，1994）。施用誘導(dǎo)菌可誘導(dǎo)植物在侵染點(diǎn)產(chǎn)生植保素如萜烯類和其它抑菌物質(zhì)。許多研究證明，過氧化物酶（ 多酚氧化酶（ 苯丙氨酸解氨酶（ 脂氧合酶（ 超氧化物歧化酶（ 查爾酮合成酶 (抗病酶在誘導(dǎo)后其活性和水平顯著增加，同工酶譜帶增多。在眾多的 白中，以水解酶類如 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶研究的最為詳盡。 植保素是 植物受病原微生物或非病原微生物以及其它因素刺激，而在受感染或受刺激的部位及其周圍產(chǎn)生和積累的具有抗菌活性的低分子量化合物，是植物受病原菌侵染后防衛(wèi)反應(yīng)在生化上的重要表現(xiàn)。由于植保素具有侵染可誘導(dǎo)性和體外抗菌活性 , 它的合成和累積被認(rèn)為是植物的一種重要抗病機(jī)制。真菌、病毒、細(xì)菌以及它們的代謝物、細(xì)胞壁多糖、糖蛋白、脂肪酸、寡聚糖以及一些非生物誘導(dǎo)劑如紫外線、重金屬、硅（ R， 1995）、代謝抑制劑等均能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生植保素（ ,2003）。酚類物質(zhì)是植保素、木質(zhì)素合成的前體，而其 本身和它的氧化產(chǎn)物醌都對(duì)病原菌都有很強(qiáng)的毒性，所以植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的增加，不但自身的抗菌作用增強(qiáng)，而且也使病源物侵染處木質(zhì)化程度增強(qiáng)，因此使植物抗病能力增強(qiáng)。 子生物學(xué)機(jī)理 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和分子植物病理學(xué)的不斷發(fā)展，植物誘導(dǎo)抗性機(jī)理也深入到分子水平。 物防衛(wèi)反應(yīng) 植株受到微生物誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)抗性反應(yīng)中與末端產(chǎn)物積累有關(guān)的編碼基因并不是抗病基因，其中大多數(shù)屬于致病相關(guān)蛋白質(zhì)（ 編碼基因，而其中大多數(shù)的蛋白質(zhì)能夠抑制病原微 生物的生長與繁殖，如幾丁中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 質(zhì)酶、 1,3 葡聚糖酶等。同時(shí)在被侵染的部位還會(huì)有不同類型的植物防衛(wèi)相關(guān)蛋白質(zhì)（ 合成，它們同樣具有重要的抗病作用。楊依軍等（ 1997）利用層析、離子交換以及特異免疫化學(xué)分析的方法對(duì)誘導(dǎo)性蛋白酶進(jìn)行分離純化及鑒定分析，結(jié)果從非親和性稻瘟菌侵染的稻葉中純化了脂氧合酶（ 兩種同工酶 鑒定了其血清學(xué)關(guān)系。 病基因與無毒基因 早在 1941 年， 人在有關(guān)亞麻（ ） 與亞麻柵銹菌（ 互關(guān)系的研究中就已發(fā)現(xiàn)，亞麻的 R 基因是顯性的，而控制亞麻柵銹菌產(chǎn)生抗 R 基因突變小種的基因是隱性的。據(jù)此他提出了植物與病原體之間相互關(guān)系的“基因?qū)颉奔僬f（“ 假說認(rèn)為，對(duì)病原體表現(xiàn)抗性（或不相容性）的植株必定存在著一種 R 基因，而在病原體中也必定存在著與之對(duì)應(yīng)的 因；這兩種基因中的任何一種的缺失或功能的喪失，寄主植株與病原體之間就不能發(fā)生相 互作用，抗病反應(yīng)就不會(huì)被激活，結(jié)果導(dǎo)致寄主植株染病。以后的大量研究證明，微生物與植物的相互作用，都遵循這“基因?qū)颉钡年P(guān)系。 植物的抗病基因與病原微生物的無毒基因，在植物與病原微生物的相互適應(yīng)過程中失協(xié)同進(jìn)化的。病原微生物可以通過 缺失或突變來避開植物“基因?qū)颉钡目共》佬l(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)，是自身得以生存，另一方面在進(jìn)化的過程中，植物又必須產(chǎn)生處新的抗病基因，用以抵抗病原體的侵染。 近些年來，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，通過科學(xué)工作者的不懈努力，已經(jīng)從有關(guān)的植物中至少分離到了至少 20 種以上的不同的抗病基因，從細(xì)菌 中已經(jīng)至少分離到 40 個(gè)以上的無毒基因，從病毒中也分離到了數(shù)種無毒基因（包括煙草花葉病毒的外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因和運(yùn)動(dòng)蛋白基因等），從真菌中分離到的無毒基因較少，現(xiàn)在僅分離得到番茄的葉霉病菌暗黃枝孢（ 的 番茄葉霉病原菌的無毒基因 乃虎， 1998）。 導(dǎo)抗病性信號(hào)傳導(dǎo) 誘抗菌誘發(fā)基因表達(dá)時(shí)一般能都涉及信號(hào)傳導(dǎo)問題。目前認(rèn)為，傳導(dǎo)信號(hào)的分子可能是水楊酸（ 、乙烯、茉莉酮酸和茉莉酮酸甲酯（ 1992；1993） 。水楊酸作為系統(tǒng)獲得抗性必不可少的信號(hào)分子已得到證明。但水楊酸并非通常理解的可以通過輸導(dǎo)組織送到遠(yuǎn)處組織的信號(hào)分子；在遠(yuǎn)處組織建立系統(tǒng)抗性所需的水楊酸是由另外的可移動(dòng)的因子或信號(hào)轉(zhuǎn)換成的。近年的研究表明，在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞途徑中，誘導(dǎo)菌通過與特異受體結(jié)合，將信號(hào)跨膜傳遞到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，經(jīng)過一系列信號(hào)傳導(dǎo)，包括離子通道打開、活性氧爆發(fā)蛋白激酶的活化等，使細(xì)胞核內(nèi)防衛(wèi)基因表達(dá)，產(chǎn)生防御物質(zhì)以抵抗病原菌的侵染。信號(hào)傳遞不斷激起人們的重視，是誘導(dǎo)抗性研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 3本論文研究目的和意義 本研究以黃瓜黃化 苗、瓜枝孢弱毒菌株及其對(duì)應(yīng)強(qiáng)毒菌株為試驗(yàn)材料，對(duì)瓜枝孢弱毒菌株誘導(dǎo)寄主抗病性、誘導(dǎo)寄主系統(tǒng)抗病性及其相關(guān)遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并從菌體形態(tài)特征、細(xì)胞壁降解酶、可溶性蛋白等形態(tài)特征和生理生化方面顯著變化來對(duì)瓜枝孢弱毒菌株致弱機(jī)理進(jìn)行了研究，最后，對(duì)瓜枝孢弱毒菌株的分子生物學(xué)機(jī)理進(jìn)行了預(yù)測和展望。 植物誘導(dǎo)性抗病是植物適應(yīng)外界環(huán)境的一種反應(yīng)。通過本文的研究，以期能夠闡明弱毒菌株誘導(dǎo)植物抗病性的產(chǎn)生條件、表達(dá)規(guī)律、機(jī)制以及與植物正常生命活動(dòng)的關(guān)系；并為克隆相關(guān)弱毒菌無病基因、寄主植物抗病基因和開發(fā)植物真菌疫苗 ，提供強(qiáng)有力的理論支持和科學(xué)依據(jù)，從而完善病原微生物和寄主植物之間的互作機(jī)制的研究，進(jìn)一步豐富我國在誘導(dǎo)抗病機(jī)制領(lǐng)域的科研成果，推動(dòng)農(nóng)作物病害綜合防治體系的建立。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 瓜 枝 孢 弱 毒 菌 株 致 弱 機(jī) 理 研 究 7 第二章 瓜枝孢弱毒菌株誘導(dǎo)黃瓜抗病性研究 早在 1901 年， 報(bào)道了可以用銹菌的弱毒小種感染小麥來抵抗銹菌的再次侵染。 1939 年 在真菌病害中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，這引起了植物病理學(xué)家的高度重視。 誘導(dǎo)抗病性是 通過在植株局部接種，使整個(gè)植株獲得系統(tǒng)性抗病性，從而保護(hù)植株在整個(gè)生長期內(nèi)免受病害的侵襲。用弱毒菌系誘導(dǎo)植物抗病性 實(shí)現(xiàn)了植物不同部分的溝通， 改變了寄主 、弱毒菌系都具有與植物發(fā)生前期互作的能力，但前者能把互作繼續(xù)發(fā)展為建立寄生關(guān)系并使其發(fā)病，后者在給予寄主刺激后就停止互作向抗寄生關(guān)系方面發(fā)展，而這個(gè)刺激可以誘導(dǎo)植物的抗性。其基本思想是：把同種或近緣的弱毒菌系接種于寄主，使被保護(hù)的植物獲得對(duì)強(qiáng)毒菌系的抗性，又稱獲得性免疫。 本章以黃瓜黃化苗為供試菌株，選取課題組自主篩選的瓜枝孢弱毒菌株及其對(duì)應(yīng)的強(qiáng)毒菌株，通過黃瓜黃化苗子葉噴霧接種法系統(tǒng)研究了瓜枝孢弱毒菌株弱致病性、誘導(dǎo)黃瓜抗病性及其遺傳穩(wěn)定性；通過 黃瓜黃化苗根部涂抹法和子葉涂抹法系統(tǒng)研究了誘導(dǎo)黃瓜系統(tǒng)抗病性及其遺傳穩(wěn)定性等內(nèi)容，同時(shí)并詳細(xì)研究了相關(guān)影響因子對(duì)瓜枝孢弱毒菌株誘導(dǎo)黃瓜抗病性、誘導(dǎo)黃瓜系統(tǒng)抗病性的影響。這為下一章研究瓜枝孢弱毒菌致弱機(jī)理提供必要的理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。 1 瓜枝孢弱毒菌株弱致病性研究 料與方法 料 試植株 “山東密刺”黃瓜黃化苗：參照李寶聚（ 1997）方法，將黃瓜種子經(jīng) 升汞表面消毒 5，在 20恒溫箱中催芽 24h，然后排放于高溫滅菌、底部鋪有雙層紗布的保濕塑料盒中， 20恒溫箱中黑暗培養(yǎng) 2d 待黃化苗種殼脫落后備用。試驗(yàn)用黃化苗一直在 20恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，以后略同。 試菌株 瓜枝孢弱毒菌株： 434322323323 瓜枝孢強(qiáng)毒菌株： 432323。 要儀器 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 瓜 枝 孢 弱 毒 菌 株 致 弱 機(jī) 理 研 究 8 超凈工作 臺(tái) （ 北京市西城區(qū)半導(dǎo)體設(shè)備一廠 ）、 恒溫箱培養(yǎng)箱 （ 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 ， ）、 滅菌鍋 （ O. ）、干燥 箱 （ 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠 ， 101 ）、 微波爐 （ ）、 光學(xué)顯微鏡 （ 相機(jī)（ 。 要試劑 汞溶液 法 株活化、培養(yǎng) 將瓜枝孢弱毒菌原始菌株（ 434322323323別在 板培養(yǎng)基上活化后培養(yǎng) 4d 備用。 霧接種 用無離子水將弱毒菌株 （ 434322323323別配制成濃度為 2 106 個(gè) /孢子懸液，以噴霧法接種在黃瓜黃化苗子葉上， 23恒溫箱中繼續(xù)黑暗培養(yǎng)。每處理皆設(shè) 3 次重復(fù)，每個(gè)保濕盒（ 42 株黃瓜黃化苗）為一個(gè)重復(fù)，每重復(fù)噴霧法接種液體定量均為 15 立對(duì)照 以接種各自對(duì)應(yīng)的強(qiáng)毒菌株 （ 432323）濃度為 2 106 個(gè) /子懸液的黃瓜黃化苗 子葉 為對(duì)照。 情調(diào)查 噴霧法接種后第 3d、 5d 分別調(diào)查發(fā)病情況，并記錄。 害分級(jí)與數(shù)據(jù)處理 病害分級(jí)： 借鑒李寶聚（ 1997）對(duì)黃瓜黑星病菌侵染黃化子葉病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。 0 級(jí)：無癥狀； 1 級(jí)：子葉出現(xiàn)可見的紅褐色小點(diǎn)； 2 級(jí)：子葉出現(xiàn)少量的紅褐色小點(diǎn)； 3 級(jí)：子葉紅褐色病斑占葉面積 1/3 以內(nèi)； 4 級(jí)：子葉紅褐色病斑占葉面積 1/3； 5 級(jí)：子葉紅褐色病斑占葉面積 2/3 以上。 數(shù)據(jù)處理： 病情指數(shù) （各級(jí)病葉數(shù) 相應(yīng)級(jí)數(shù)）