密級(jí) 論文編號(hào) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 三個(gè)與水稻株型相關(guān)突變體的鑒定 與基因克隆 I 摘 要 隨著水稻基因組測(cè)序計(jì)劃的全面完成，闡明基因的生物學(xué)功能成為后基因組時(shí)代的重要研究?jī)?nèi) 容，而水稻的株型是構(gòu)成產(chǎn)量的主要因素，對(duì)水稻株型發(fā)育的分子機(jī)理的了解可以為育種提供理論基礎(chǔ)。我們從 入水稻突變體庫中，篩選到三個(gè)與株型相關(guān)的突變體 :短穗大葉角 莖稈螺旋 并對(duì)這 3個(gè)突變體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定、遺傳分析和初步的生理學(xué)研究，克隆了 要結(jié)果如下： 1. 現(xiàn)為半矮化、穗型短而密 集、葉片窄、抽穗延遲等特點(diǎn)， 且 花器官數(shù)目增加，結(jié)實(shí)率低，穗軸和枝梗伸長(zhǎng)受到抑制，該 突變體 屬于 發(fā)現(xiàn) 突變體對(duì) 溫度敏感；遺傳分析證實(shí) 穩(wěn)定遺傳的且受一對(duì)不完全顯性核基因控制； 對(duì)照植株用生型植株的株高 7%，而 步確定 2. 對(duì) 變體自交和雜交后代植株進(jìn)行 性分析，并用 交證明用 中 果 入到 第 5染色體的 一個(gè)同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子基因中； 對(duì) 碼產(chǎn)物進(jìn)行了同源性分析；用 析了的器官表達(dá)，表明、葉、穗中 呈組成型 表達(dá)； 3. 利用酵母自激活研究了轉(zhuǎn)錄因子 激活功能， 以成功激活報(bào)告基因的表達(dá)；研究了其他禾谷類作物是否 具 果野生稻中含有該同源基因，而小麥、玉米、高粱、甘蔗無明顯的同源基因；構(gòu)建了 載體，遺傳轉(zhuǎn)化正在進(jìn)行； 4. 對(duì) 變體的特征進(jìn)行了 鑒定 ， 株半矮化、葉角度大、葉片微卷和抽穗期延遲，突變體矮化類型也屬于 穩(wěn)定遺傳且受一對(duì)隱性核基因控制； 一染色體的 一個(gè) 據(jù)已有報(bào)道，將該基因命名為 對(duì) 明 根、莖、葉、穗中 呈組成型 表達(dá)；用 行亞細(xì)胞定位表明 5. 對(duì) 變體進(jìn)行了鑒定，突變體苗期葉鞘彎曲、螺旋生長(zhǎng)，分蘗期表現(xiàn)為分蘗角度變大、半矮化、遲抽穗、育性較差等特點(diǎn)；苗期取彎曲生長(zhǎng)的葉鞘進(jìn)行石蠟切片，發(fā)現(xiàn)彎曲部位的細(xì)胞排列緊密； 性分析表明突變體與 是共分離。 關(guān)鍵詞 水稻，株型， 簽，基因克隆 of of in in of to , of as 1. p2 p2 by a A3 at p2 to 2. p2 in a in . in 3. RF in of in 4. by A3 at to A3 at in t to of by a in a in . LA in in 5. at at of at in in as a of by a 錄 摘 要 . I . 要符號(hào)表 . 一部分 文獻(xiàn)綜述 . 1 第一章 水稻中的 簽 . 1 . 1 . 1 . 2 . 2 . 2 簽基因的分離 . 3 . 3 . 4 第二章 水稻株型發(fā)育的分子生物學(xué)研究進(jìn)展 . 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . 6 . 8 . 9 第三章 植物中的轉(zhuǎn)錄因子 . 10 . 10 . 10 . 10 錄因子 . 10 . 11 . 11 . 12 . 12 . 12 第四章 植物中的反向遺傳學(xué) . 14 . 14 . 14 義 作用機(jī)理 . 14 義 應(yīng)用 . 14 . 15 . 15 . 15 . 16 V . 16 因打靶概述 . 16 因打靶的操作步驟 . 16 因打靶在植物中的應(yīng)用 . 17 . 18 術(shù)的問世 . 18 術(shù)的操作過程 . 18 術(shù)的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì) . 19 術(shù)的應(yīng)用 . 20 結(jié) 語 . 21 第五章 本研究的目的和意義 . 22 第二部分 研究論文 . 23 第一章 水稻短穗突變體的鑒定與基因克隆 . 23 . 23 . 24 . 24 . 24 . 25 . 25 . 25 . 26 . 26 . 26 . 26 . 26 . 26 . 27 交 . 27 . 27 . 27 . 28 . 28 . 29 . 30 . 30 . 30 . 30 . 35 . 35 . 36 . 36 . 38 . 42 共分離的分子生物學(xué)證據(jù) . 43 . 44 . 46 . 46 . 49 . 49 . 52 . 52 . 53 . 53 . 53 . 54 第二章 大葉角突變體的鑒定與基因克隆 . 55 言 . 55 . 55 料和方法 . 55 . 56 . 56 . 56 . 56 . 56 . 57 . 57 . 57 . 57 果與分析 . 58 . 58 . 60 . 61 . 62 . 63 . 64 . 65 . 66 亞細(xì)胞定位 . 67 論 . 69 與植物的發(fā)育調(diào)節(jié) . 69 . 69 . 69 第三章 莖桿螺旋突變體的鑒定與遺傳分析 . 70 . 70 . 70 . 70 組織切片 . 71 . 71 . 71 . 71 . 71 . 74 . 75 . 76 . 76 . 76 . 77 . 77 . 77 結(jié) 論 . 78 參考文獻(xiàn) . 79 附錄 1 基本實(shí)驗(yàn)方法 . 96 附錄 2 主要試劑及 培養(yǎng)基的配方 . 103 致 謝 . 106 作者簡(jiǎn)歷 . 107 要符號(hào)表 菌人工染色體 基對(duì) 補(bǔ) 摩爾根 乙基焦碳酸鹽 氧核糖核苷三磷酸 (4 種 ) 巰基蘇糖醇 腸桿菌 二胺四乙酸 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 霉素 丙基 那霉素 堿基 B 培養(yǎng)基 堿基 升 爾 開放閱讀框 1于 人工染色體 丙烯酰胺凝膠電流 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 稻基因組研究計(jì)劃 NA 涉 分鐘轉(zhuǎn)速 二烷基肌酸鈉 二烷基磺酸鈉 準(zhǔn)檸檬酸鈉鹽溶液 度不對(duì)稱 NA 熱水生菌 合酶 43 移 轉(zhuǎn)錄 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 水稻中的 簽 1 第一部分 文獻(xiàn)綜述 第一章 水稻中的 簽 言 隨著水稻基因組測(cè)序計(jì)劃的全面完成（ Yu et 002;et 002； et 002; et 002），以研究基因的生物學(xué)功能為標(biāo)志的功能基因組學(xué)研究成為后基因組時(shí)代的核心任務(wù)。功能基因組學(xué)主要是在基因組水平上全面分析基因的生物學(xué)功能和他們之間的相互關(guān)系，以及在植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、環(huán)境應(yīng)答等過程的時(shí)空特異表達(dá)及調(diào)控機(jī)制。與結(jié)構(gòu)基因組學(xué)不同，功能基因組學(xué)是對(duì)基因及其功能進(jìn)行研究，一旦獲得基因的部分或全部信息，研究者即可就該基因申請(qǐng)相關(guān)的專利。水稻的基因數(shù)目是有限的，在基因的巨大商業(yè)前景和應(yīng)用價(jià)值的驅(qū)使下，各國政府 和商業(yè)公司紛紛斥巨資投入對(duì)水稻功能基因組學(xué)的研究，分離具重要農(nóng)藝性狀（如高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)及抗逆性等）的基因成為投資者的基本目標(biāo)之一。 變體庫的構(gòu)建 突變體是遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)材料，綜觀遺傳學(xué)的發(fā)展歷程，從遺傳學(xué)三大規(guī)律的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的兩次綠色革命的引發(fā)，都與突變體的發(fā)現(xiàn)和利用密切相關(guān)，隨著后基因組時(shí)代的到來，建立飽和的突變體庫成為水稻功能基因組學(xué)研究的必要組成部分。目前，水稻突變體庫的構(gòu)建主要有以下方法：（ 1）自發(fā)突變，由于自發(fā)突變頻率低，很難獲得飽和的突變?nèi)后w。（ 2）理化誘變，利用各種射線或化學(xué)誘 變劑處理種子或幼苗，這類突變較容易獲得飽和的突變體，目前應(yīng)用比較成熟，但容易使染色體造成大量的畸變，突變的隨機(jī)性使隨后的基因分析與克隆帶來很大的困難。（ 3）基因標(biāo)簽法，將 轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入水稻中獲得插入的突變?nèi)后w，用于隨后的正向和反向遺傳學(xué)研究。其中， 利用玉米的轉(zhuǎn)座子 s 構(gòu)建水稻插入突變體庫也是應(yīng)用較多的方法之一。 驗(yàn)室利用 ,000多個(gè)插入的水稻突變體庫（ ， et 1999），中科院上海植生所 和中國水稻研究所利用 ,000多株插入群體，并正在進(jìn)行突變體庫的后續(xù)分析（王江等， 2000；朱正歌， 2001； et 2003）。近年來，眾多研究機(jī)構(gòu)構(gòu)建了大量的轉(zhuǎn)座子突變體庫（ et 1999； et 2001; et 2001； et 2004； et 2004； et 2004; et 2004; et 2004），并有利用轉(zhuǎn)座子克 隆水稻新基因的報(bào)道（ et 2003; et 2005）。但是總體來說這些標(biāo)簽系統(tǒng)沒有達(dá)到預(yù)想的效果。 日本的 2,000個(gè)個(gè)體的 et 1996； et 1997; et 2000; et 2001），并利用該群體分離了包括 et 2001；et 2001； et 2001； et 2003； et 2004 ）。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 水稻中的 簽 2 由于 簽法在包括擬南芥在內(nèi)的眾多植物中獲得了巨大成功，近年來水稻中也構(gòu)建了大量的 文就 簽 述 位于農(nóng)桿菌內(nèi) Ti( Ri(粒上的一段 可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中， 插入特點(diǎn) 由于 合的模式比較復(fù)雜，因此對(duì) 入特點(diǎn)的充分了解將有利于對(duì)突變體庫作系統(tǒng)研究。目前了解的插入特點(diǎn)主要表現(xiàn)在以下方面 : 首先， 初的研究結(jié)果表明， 最近研究顯示， 合到染色體 會(huì)引起染色體重排（ et 998;et 999; et 000; et 002），當(dāng)基因組中導(dǎo)入大片段的外源 發(fā)生大范圍的染色體重組（ et 005），這些特點(diǎn)為隨后的突變體分析帶來相應(yīng)的困難； 其次， 入的偏好性。其一是對(duì)宿主基因表達(dá)區(qū)域的偏好性，最初的雙子葉植物研究表明， et 1994； et 2000）。近來的研究表明， et 2002; et 002），最近對(duì)水稻的研究也發(fā)現(xiàn)， 一特點(diǎn)使得構(gòu)建飽和突變體庫所需的群體大大縮小（ et 000; et 001； et 000 ； et 003； et 004）；其二是 期研究認(rèn)為 隨機(jī) 整合到基因組 中。但隨后在擬南芥中的研究證明 、 3調(diào)節(jié)區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域（ et 2002， et 2002），對(duì)水稻中插入的 究結(jié)果得出類似結(jié)論， 00 5、 3調(diào)節(jié)區(qū)和內(nèi)含子中（ et 1997； et 003；et 004）。同時(shí)，對(duì) 前已有初步結(jié)論， et 002），對(duì)水稻插入突變體的旁側(cè)序列分析表明， 合位點(diǎn)處的基因組 界有小部分的同源性（ et 004）。 最后， 多的研究結(jié)果表明， 且并非所有的位點(diǎn) 中 有部分或整個(gè)載體序列整合進(jìn)基因組中，甚至存在多拷貝的串聯(lián)重復(fù)（ et 004; et 004）。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 水稻中的 簽 3 上述特點(diǎn)的存在增加了 基因表達(dá)影響的復(fù)雜性，很大程度上不利于后代的功能分析。 簽基因的分離 分離 1） 質(zhì)粒拯救法。直接通過內(nèi)切酶酶切突變體染色體 接、環(huán)化、轉(zhuǎn)化細(xì)菌，篩選出含 et 992;）； 2） 基于 根據(jù) 選突變體的基因文庫，再以篩選到的突變體的克隆部分序列為探針篩選野生型的基因文庫，從而獲得 完整基因的克隆； 3） 基于 已知 過反向 et 1990）， et 1995）等方法擴(kuò)增 以擴(kuò)增出的旁側(cè)序列為探針或進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物篩選野生型基因文庫，即可得到與突變相應(yīng)的完整基因的克隆。通過將克隆到的基因轉(zhuǎn)化突變體，進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)從而驗(yàn)證基因的功能。其中 簽的改進(jìn) 傳統(tǒng)的 簽策略在鑒定胚胎早期易發(fā)生致死突變的發(fā)育基因，以及研究微效多基因及基因間的補(bǔ)償作用時(shí)明顯存在不足。因此，需要發(fā)展新的