第一章緒論 發(fā)酵與發(fā)酵技術(shù)的定義發(fā)酵產(chǎn)物的類型發(fā)酵工業(yè)的特點(diǎn)與范圍 發(fā)酵1 來源 酵母作用產(chǎn)生氣泡 酒的生產(chǎn) 2 狹義 生化意義指在無氧條件下一個有機(jī)化合物能同時作為電子供體和最終電子受體并產(chǎn)生能量的過程 3 廣義 工業(yè)發(fā)酵利用微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制造產(chǎn)品的過程 定義 發(fā)酵技術(shù)指以微生物為主要操作對象的生物工程技術(shù) eg 基因工程技術(shù)在發(fā)酵工程上的應(yīng)用 定義 微生物菌體 傳統(tǒng)菌體發(fā)酵工業(yè)現(xiàn)代菌體發(fā)酵工業(yè) 酵母發(fā)酵 菌體蛋白 單細(xì)胞蛋白 發(fā)酵 殺蟲劑 蘇云金桿菌 蠟樣芽孢桿菌 側(cè)孢芽孢桿菌 白僵菌 綠僵菌 疫苗 新的菌體發(fā)酵產(chǎn)品 藥用功能菌體茯苓菌 茯苓擔(dān)子真菌 靈芝 香菇類蟲草頭孢菌密環(huán)菌 微生物菌體 面包酵母 藻類 芽孢桿菌和伴孢晶體 蟲草頭孢菌發(fā)酵生產(chǎn)蟲草 發(fā)酵產(chǎn)物的類型 初級代謝產(chǎn)物初級代謝 能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì) 維持微生物正常生命活動的生理活性物質(zhì)或能量的代謝 初級代謝產(chǎn)物 微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的 自身生長和繁殖所必需的物質(zhì) 特征 不同的微生物初級代謝產(chǎn)物基本相同 初級代謝產(chǎn)物合成過程是連續(xù)不斷的 次級代謝產(chǎn)物次級代謝 指某些微生物進(jìn)行的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)和維持其正常生命活動的非必須物質(zhì)的代謝次級代謝產(chǎn)物 微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜 對該微生物無明顯生理功能 或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì) 特征 不同的微生物次級代謝產(chǎn)物不同 作用因種類不同而異 酶制劑 廣泛用于醫(yī)藥工業(yè) 食品和輕工業(yè) 石油化工酶試劑盒 醫(yī)用診斷試劑盒 工業(yè)分析試劑盒等藥用酶制劑 膽固醇氧化酶 葡萄糖氧化酶等食品工業(yè)用酶制劑 果膠酶 淀粉酶等基因重組技術(shù)用酶制劑 核酸酶 nuclease 包括DNA RNA的內(nèi)切酶 外切酶 DNA限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶等 飼料酶制劑 木聚糖酶 葡聚糖酶 纖維素酶等 微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過微生物細(xì)胞將一個化合物轉(zhuǎn)變成另一個結(jié)構(gòu)相關(guān) 更具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物 發(fā)酵產(chǎn)物的類型 發(fā)酵工業(yè)的特點(diǎn)與范圍 發(fā)酵工業(yè)的特點(diǎn)門類眾多技術(shù)發(fā)展迅速節(jié)約資源 有益環(huán)境生產(chǎn)過程獨(dú)特 發(fā)酵工業(yè)的范圍釀酒食品有機(jī)溶劑發(fā)酵有機(jī)酸發(fā)酵抗生素工業(yè)酶制劑氨基酸核苷酸類物質(zhì)維生素生理活性物質(zhì)微生物菌體蛋白發(fā)酵微生物環(huán)境凈化生物能工業(yè)微生物冶金工業(yè) 第二章工業(yè)微生物菌種的選育 保藏與培養(yǎng) 在微生物工業(yè)應(yīng)用中 微生物菌種工作主要包括 菌種的分離篩選 挑選符合生產(chǎn)要求的菌種 這是選種工作的任務(wù) 菌種培育 改良已有菌種的生產(chǎn)性能 使產(chǎn)品的質(zhì)和量不斷提高 或使它更適應(yīng)于工藝的要求 這是育種工作的任務(wù) 菌種的保藏 一切生產(chǎn)菌種都要使它避免死亡和生產(chǎn)性能的下降 這是菌種保藏工作的任務(wù) 退化菌種的復(fù)壯 如果發(fā)現(xiàn)菌種的生產(chǎn)性能下降 就要設(shè)法使它恢復(fù) 這是菌種復(fù)壯工作的任務(wù) 細(xì)菌 bacteria 常用的有枯草芽孢桿菌 醋酸桿菌 棒狀桿菌 短桿菌等 酵母菌 yeast 屬單細(xì)胞真核生物 主要分布于含糖較多的酸性環(huán)境中 常用的有 啤酒酵母屬 假絲酵母屬 類酵母等 啤酒酵母 棒狀桿菌 短桿菌棒狀桿菌 yeasts 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物 第一節(jié)工業(yè)微生物常用菌種 第二節(jié)工業(yè)微生物常用菌種 霉菌 mould 喜偏酸性環(huán)境 可用于生產(chǎn)多種酶制劑 抗生素 有機(jī)酸及甾體激素等 放線菌 actionmycetes 原核微生物類群 在含有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中分布較為廣泛 主要用于生產(chǎn)多種抗生素 放線菌 霉菌 微生物工業(yè)對菌種的要求 原料廉價(jià) 生長迅速 目的產(chǎn)物產(chǎn)量高 易于控制 酶活性高 發(fā)酵周期較短 抗雜菌和噬菌體能力強(qiáng) 菌種遺傳性能穩(wěn)定 不易變異和退化 不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素 工業(yè)微生物菌種的獲得途徑從微生物菌種保藏機(jī)構(gòu)購買菌種從自然界或現(xiàn)有菌種中分離篩選菌種對篩選出的菌種進(jìn)行改良從而獲得新種 第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的選育 國內(nèi) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會 一 微生物菌種保藏機(jī)構(gòu) 采樣 增殖培養(yǎng) 純種分離 純培養(yǎng) 生產(chǎn)性能測定 方法 地點(diǎn) 時間和周圍環(huán)境記錄 純種分離就是獲得單個菌落 1 稀釋分離法2 平板劃線分離法 涂菌 劃線分離3 組織分離法 測定代謝產(chǎn)物或其它目的性狀 二 從自然界或現(xiàn)有菌種中分離篩選菌種 采樣采樣地點(diǎn)森林枯枝落葉 朽木 產(chǎn)纖維素酶的菌種油田附近土壤 石油酵母污染土壤 甲烷產(chǎn)生菌果園 菜園等富含碳水化合物的土壤和沼澤土 酵母菌 霉菌菜園土 沼澤土 耕作過的 細(xì)菌 放線菌淀粉加工廠 糕點(diǎn)廠 酒廠 淀粉酶 糖化酶產(chǎn)生菌 采樣時間雨水少 溫度適中的秋初采樣無菌刮鏟 土樣采集器等采集有代表性的樣品 取離地面50 150mm處的土 裝入牛皮紙袋或玻璃瓶中 貼上標(biāo)簽 樣品種類 采集日期 地點(diǎn) 地理 生態(tài)參數(shù) 2 增殖培養(yǎng)控制培養(yǎng)基中碳源種類添加某些抑制因子或促進(jìn)因子控制培養(yǎng)條件 3 純種分離及純培養(yǎng)稀釋分離法劃線分離法組織分離法 挑取菌落 用木制接種棒挑取分離良好的單菌落 4 生產(chǎn)性能測定野生型菌株采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 通過三角瓶進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn) 結(jié)果有兩種可能 獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株 幾種選育方法 自然選育誘變育種雜交育種分子育種 經(jīng)驗(yàn)育種 定向育種 主要通過突變和篩選來獲得優(yōu)良菌株 主要通過DNA重組來獲得優(yōu)良菌株 三 微生物菌種的自然選育 自然選育在生產(chǎn)過程中 不經(jīng)過人工處理 利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程叫做自然選育 菌種的自然突變往往有兩種可能性 菌種衰退 生產(chǎn)性能下降 代謝更加旺盛 生產(chǎn)性能提高 四 微生物菌種的誘變選育 一 誘變育種的一般步驟用人工的方法處理微生物 使他們發(fā)生突變 再從中篩選出符合要求的突變菌株 供生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)用 出發(fā)菌株選擇 誘變處理 篩選突變株 1 出發(fā)菌株的選擇自然界直接分離到的野生型菌株經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株2 同步培養(yǎng)3 制備單細(xì)胞或單孢子菌懸液 4 誘變處理常用的誘變劑主要有紫外線 硫酸二乙酯 NTG NMU根據(jù)誘變劑用量對菌體致死率的曲線選擇合適的處理劑量 一般突變率隨誘變劑量的增大而增高 但達(dá)到一定劑量后 突變率會下降 5 篩選變異菌株初篩 從分離得到的大量微生物中 將目標(biāo)微生物篩選出來的過程 一般采用平板篩選 復(fù)篩 在初篩的基礎(chǔ)上 進(jìn)一步鑒定有希望菌株的生產(chǎn)能力強(qiáng)弱的過程 復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后 發(fā)酵液采用精確的分析方法進(jìn)行測定 二 營養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選 1 術(shù)語營養(yǎng)缺陷型野生型原養(yǎng)型基本培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基 2 營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法 1 誘變劑處理 2 淘汰野生型菌株 抗生素法 細(xì)菌用青霉素法 酵母菌用制霉素法 菌絲過濾法 真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)長成菌絲 而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā) 二 營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選 夾層培養(yǎng)法 限量補(bǔ)充培養(yǎng) 影印接種法 逐個檢出法 3 檢出營養(yǎng)缺陷型 影印法 4 鑒定營養(yǎng)缺陷型 含營養(yǎng)缺陷型菌株的基本培養(yǎng)基平板的制備 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)類別的鑒定 氨基酸 維生素 堿基 缺陷型菌株單一營養(yǎng)因素的鑒定 第三節(jié)工業(yè)微生物菌種的保藏 理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件 1 經(jīng)長期保藏后菌種存活健在 2 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型 特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力 3 菌種保藏的基本措施是低溫 干燥 真空 一 菌種保藏原理 保藏目的 提高存活率 減少變異 盡量保持優(yōu)良性能 原理DNA復(fù)制時自發(fā)突變導(dǎo)致菌種退化 因此要創(chuàng)造代謝不活潑的狀態(tài) 休眠態(tài) 孢子 芽孢 代謝不活潑的狀態(tài)環(huán)境 干燥 低溫 缺氧 缺營養(yǎng) 二 菌種保藏的方法 斜面低溫保藏法液體石蠟覆蓋保藏法液氮超低溫保藏法沙土管保藏法冷凍干燥保藏法 1 斜面低溫保藏法 傳代保藏 保藏方法 將菌種定期在新鮮瓊脂斜面基本培養(yǎng)基上傳代 4 左右保藏保藏期限 一般1 6月優(yōu)點(diǎn) 方法簡單 存活率高 具有一定的保藏效果 缺點(diǎn) 菌種仍有一定的強(qiáng)度的代謝活動條件 保存時間不長 傳代多 菌種容易變異及退化 適用菌種 細(xì)菌 酵母 防線菌 霉菌 2 液體石蠟覆蓋保藏法保藏方法 將生長好的斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟 油層高于斜面末端1cm 然后直立放于冰箱中保存 保藏期限 一般為1 10年注意事項(xiàng) 對菌株應(yīng)預(yù)先作石蠟培養(yǎng)試驗(yàn) 保藏株2 3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn) 此方法簡便有效 可用于霉菌 酵母 放線菌和好氧細(xì)菌的保藏 3 液氮超低溫保藏法保藏方法 用冷凍保護(hù)劑制備菌懸液 混勻 取0 5 lml分裝玻璃安瓿管 酒精噴燈封口 以1 2 min快速冷凍至細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn) 35 左右 迅速移入液氮罐中于液相 196 或氣相 156 中保存保藏期限 一般可達(dá)10年以上復(fù)蘇方法 從液氮罐中取出后立即將安瓿管置于38 40 水浴中 急速溶解后 開啟安瓿接種培養(yǎng)注意事項(xiàng) 保護(hù)劑最終濃度為10 甘油 或5 二甲亞砜 甘油為高壓蒸汽滅菌 二甲亞砜最好為過濾滅菌 適用于各種微生物 安瓿管 4 沙土管保藏法保藏方法 制備沙土管 斜面培養(yǎng) 菌懸液 移入沙土管 干燥后熔封 低溫保藏保藏期限 因菌種而異 一般可達(dá)10年以上注意事項(xiàng) 方法簡單 保藏時間較長 復(fù)活方便 適用于產(chǎn)孢子的微生物 霉菌和放線菌 及細(xì)菌的芽孢 5 冷凍干燥保藏法 5 冷凍干燥保藏法保藏期限 10年以上注意事項(xiàng) 冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑 如脫脂乳和蔗糖 忌猛烈開啟 凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏 便于運(yùn)輸銷售 應(yīng)用廣泛 6 普通冷凍保藏法保藏方法 將菌懸液或斜面培養(yǎng)物細(xì)胞加入菌種保護(hù)劑 密封于試管或EP管內(nèi) 貯藏于冰箱的冷藏室或普通冰箱 20 中保藏期限 一般1 2年注意事項(xiàng) 經(jīng)過解凍的菌株不宜二次保藏 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度 培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封 不適宜微生物的長期保藏 二 菌種的退化與復(fù)壯 一 常見的菌種退化現(xiàn)象退化的表現(xiàn) 菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變 蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體小而少生長速度緩慢 孢子數(shù)量減少代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降 對寄主寄生能力下降 二 菌種退化的原因菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變 二 菌種的退化與復(fù)壯 三 防止菌種退化的措施1 控制傳代次數(shù)2 創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件3 利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代4 采用有效的菌種保藏方法 四 退化菌種的復(fù)壯復(fù)壯 弱毒菌種在敏感動物或細(xì)胞上多次傳代 達(dá)到毒力增強(qiáng)的目的 日本731部隊(duì)用人試驗(yàn) 目的是增強(qiáng)細(xì)菌毒力 做細(xì)菌武器使用 措施1 純種分離 稀釋平板法 平板劃線分離或涂布法2 通過寄主進(jìn)行復(fù)壯 寄生性微生物的退化菌株可通過接種至相應(yīng)昆蟲或動植物寄主體內(nèi)以提高菌株毒性 3 聯(lián)合復(fù)壯 高劑量紫外輻射