基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011 年，第 30 卷，第 5 期，第 556-563 頁Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.5, 556-563研究報(bào)告A Letter大黃歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶控制產(chǎn)物特異性基序的定點(diǎn)突變周興 1,2韋星明 2楊祥開 2鄭元濤 2龐浩 3許黎明 2黃日波 1,3*1 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 南寧, 530005; 2 廣西科學(xué)院生物研究所, 南寧, 530007; 3 生物質(zhì)能源酶解技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西科學(xué)院,南寧, 530007* 通訊作者, 摘 要大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)蔗糖異構(gòu)酶催化蔗糖異構(gòu)為異麥芽酮糖和海藻酮糖，具有一個(gè)可能控制產(chǎn)物特異性的 325RLDRD329 基序。本研究以定點(diǎn)突變方法對該基序的帶電荷氨基酸進(jìn)行突變，共構(gòu)建R325D、R328A、R328D、R328Q 和 D329N 5 個(gè)突變體。通過對突變體的酶學(xué)特性及突變體轉(zhuǎn)化蔗糖的產(chǎn)物組成分析，結(jié)果顯示所構(gòu)建突變體的 Km 值上升約 25 倍，比活力下降至野生型 SI 比活力的 11.8%25.3%。HPLC 分析顯示 Arg325 和 Arg328 分別突變?yōu)?Asp，導(dǎo)致產(chǎn)物中異麥芽酮糖 / 海藻酮糖的比例從 6.93 分別降至 0.96 和2.92，并伴隨一個(gè)未知寡糖出現(xiàn)。Arg328 突變?yōu)?Ala 和 Gln 同樣導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物中海藻酮糖比例上升，異麥芽酮 糖比例下降。但是突變體 D329N 反應(yīng)產(chǎn)物比例沒有變化。以上結(jié)果表明 325RLDRD329 基序?qū)Υ簏S歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶的酶活具有重要作用，并對酶的產(chǎn)物特異性產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果將為該酶的作用機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 蔗糖異構(gòu)酶, 定點(diǎn)突變, 產(chǎn)物特異性, 大黃歐文氏菌Site-directed Mutation in a Product-Specificity-Controlling Motif of SucroseIsomerase from Erwinia rhaponticiZhou Xing 1,2Wei Xingming 2Yang Xiangkai 2Zheng Yuantao 2Pang Hao 3Xu Liming 2Huang Ribo 1,3*1 College of Life Science and Biotechnology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 Biology Institute, Guangxi Academy of Sciences, Nanning,530007; 3 State Key Laboratory for Biomass & Enzyme Technology, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, 530007* Corresponding author, DOI: 10.3969/gab.030.000556Abstract Sucrose isomerase (SI) from Erwinia rhapontici isomerizes surcose to produce isomaltulose and tre-halulose. It has a motif (325RLDRD329) which may control the product specificity. In this study, the charged amino acid residues of the motif have been site-directedly mutated, and 5 mutants (R325D, R328A, R328D, R328Q and D329N) were obtained. By analyzing the enzymatic characteristics of the mutants and the product composition of sucrose conversion catalysed by the mutants, we found that the Km of these mutants increased by about 25 folds and the specific activity decreased to 11.8% 25.3% that of wild-type enzyme. The replacement of residues Arg325 and Arg328 respectively to residue Asp resulted in a decrease of the isomaltulose/trehalulose ratio from 6.93 to 0.96 and2.92 respectively in the reaction products and the emergence of an undetermined oligosaccharide by HPLC assay. Mutation of residue Arg328 with Ala and Gln respectively also increased the percentage of trehalulose and reduced the percentage of isomaltulose in the sucrose converted product. However, the ratio of isomaltulose/trehalulose for- mation by D329N mutant was similar to that of wild-type enzyme. Based on our results, we believe that the 325RL- DRD329 motif is essential for the activity of SI from E. rhapontici and also affects the product specificity of this en- zyme. Our results will provide a foundation for understanding the mechanism of SI.Keywords Sucrose isomerase, Site-directed mutation, Product specificity, Erwinia rhapontici蔗糖異構(gòu)酶(sucrose isomerase, SI, EC 1)是分子內(nèi)異構(gòu)酶，可以通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷作用轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目：本研究由國家科技支撐項(xiàng)目(2007BAD75D06 )和廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目(桂科攻 0895003-4-1 )共同資助蔗糖(sucrose, 2-O-D-glucopyranosyl-D-fructofuran-ase)形成異麥芽酮糖(isomaltulose, 6-O-D-glucopy- ranosyl-D-fructofuranase)和海藻酮糖(trehalulose, 1-O-D-glucopyranosyl-D-fructofuranase) (圖 1)，并伴 隨產(chǎn)生少量的蔗糖水解產(chǎn)物葡萄糖和果糖。酮糖合成酶(trehalulose synthase)。如何從 SI 序列和蛋白結(jié)構(gòu)上的差異解釋不同微生物來源的 SI 產(chǎn)物 中異麥芽酮糖和海藻酮糖比例的變化? Zhang 等 (2003b) 通過對源自克雷伯氏菌 LX3 的異麥芽酮糖 合成酶 PaI 的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析和氨基酸序列比 對，發(fā)現(xiàn) PaI 的氨基酸序列中有一個(gè)決定產(chǎn)物特異 性(product specificity)的 325RLDRD329 基序(motif)。對 該基序中 4 個(gè)帶電荷氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)果顯示突變其中任一個(gè)帶電氨基酸殘基可使轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中海藻酮糖的含量提高 17%61%，異麥芽酮糖 降低 26%67%。因此推定該基序控制著 SI 的產(chǎn)物 特異性。大黃歐文氏菌 SI 的氨基酸序列上同樣具有相 應(yīng)的 325RLDRD329 基序序列。本研究以大黃歐文氏菌NCPPB 1578 (E. rhapontic NCPPB 1578) 的 SI 為材 料，對該酶的控制產(chǎn)物特異性基序氨基酸殘基進(jìn)行點(diǎn)突變，探討該基序?qū)Υ簏S歐文氏菌 SI 酶學(xué)性質(zhì)的 影響，為 SI 的作用機(jī)理研究和分子改造提供依據(jù)。圖 1 SI 催化反應(yīng)蔗糖異構(gòu)反應(yīng)式Figure 1 Scheme of isomerization of sucrose by SI異麥芽酮糖是蔗糖的同分異構(gòu)體。與蔗糖不同，異麥芽酮糖的果糖基半縮醛羥基暴露，因此，它是一 種具有還原性的二糖。異麥芽酮糖的還原能力為葡 萄糖的 60%，甜度為蔗糖的 42% (Cheetham, 1984)。 該糖風(fēng)味與蔗糖相似，但口腔致齲齒微生物不能代 謝，所以它可以作為不致齲齒的甜味劑替代蔗糖。異 麥芽酮糖經(jīng)加氫后得到異麥芽糖醇(isomaltitol)，該 糖醇能被人體腸道中的有益微生物代謝，是一種雙 歧因子(Minami et al., 1990; Ooshima et al., 1991)，已 被廣泛地用于保健產(chǎn)品和食品工業(yè)?，F(xiàn)有的異麥芽 酮糖生產(chǎn)工藝均采用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化蔗糖工藝，轉(zhuǎn) 化過程中實(shí)際起作用的成分為菌體產(chǎn)生的 SI。目前 已有紅色精朊桿菌(Protaminobacter rubrum) (Matteset al., 1999)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica) (Fu- jii et al., 1983)和大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)固定化細(xì)胞應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)異麥芽酮糖，其中大黃歐文氏菌的細(xì)胞固定化柱半衰期可長達(dá) 8 500 h(Cheetham et al., 1982)。不同微生物來源的 SI 轉(zhuǎn)化蔗糖的產(chǎn)物，具有不 同的異麥芽酮糖和海藻酮糖的比例。紅色精朊桿菌、普城沙雷氏菌、大黃歐文氏菌、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)、克雷伯氏菌 LX3 (Klebsiella sp. LX3)和分散泛菌 UQ68J (Pantoea dispersa UQ68J)轉(zhuǎn) 化蔗糖產(chǎn)物主要是異麥芽酮糖(75%91% ) (Fujii etal., 1983; Mcallister et al., 1990; Huang et al., 1998; Mattes et al., 1998; Zhang et al., 2002; Wu and Birch,2005)，所產(chǎn)生的 SI 也稱為異麥芽酮糖合成酶(isomaltulose synthase)。而嗜溫嗜酸假單胞菌 MX-45 (Pse- udomonas mesoacidophila MX-45)和放射形土壤桿菌 MX-232 (Agrobacterium radiobacter MX-232)轉(zhuǎn)化蔗 糖產(chǎn)物為海藻酮糖(88%90%) (Miyata et al., 1992; Nagai-Miyata et al., 1993)，所產(chǎn)生的 SI 則稱為海藻1 結(jié)果與分析1.1 不同來源的 SI 氨基酸序列比對將大黃歐文氏菌 NCPPB 1578 的 SI 基因序列 (GenBank 登錄號為 AY223550)所編碼的氨基酸序 列用 Blastx 軟件檢索 GenBank 氨基酸數(shù)據(jù)庫，結(jié)果 表明與來自大黃歐文氏菌 DSM 4484 的 SI 基因編碼 的氨基酸序列 100%同源。而與克隆自大黃歐文氏菌 WAC2928 的 SI 基因編碼的氨基酸序列的同源性為98%。該基因所編碼的氨基酸序列與來自于其它微 生物的 SI 氨基酸序列有著較高的同源性。如：與來 源于克雷伯氏菌 LX3 的 SI 氨基酸序列比較，等同的71%，相似 83%；與來源于分散泛菌的 SI 氨基酸序列 比較，等同的 71%，相似 81%；與來源于嗜溫嗜酸假 單胞菌的海藻酮糖合成酶氨基酸序列比較，等同的67%，相似 78%。同時(shí)，該序列還與寡聚 -1,6- 葡萄糖 苷酶(oligo-1,6-glucosidase)有著較高的同源性，如：與來源于氣味沙雷氏菌 4Rx13 (Serratia odorifera 4Rx13)的寡聚 -1,6- 葡萄糖苷酶氨基酸序列比較，等同的81%，相似 89%。應(yīng)用 NCBI 的 COBALT multiple alignment tool對不同來源的 SI 氨基酸序列進(jìn)行多序列比對。圖 2 可以更明了地顯示不同來源的 SI 氨基酸序列具有很 高的同源性，而同源性較低的最大區(qū)域分布在 N 端 的信號肽序列區(qū)域及 C 端?；蚪M學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)Genomics and Applied Biology558圖 2 SI 氨基酸序列的比對注: E. rha: E. rhapontic (GenBank 登錄號: AY223550); K. sp: Klebsiella sp. LX3 (GenBank 登錄號: AY040843); P. mes: P. mesoaci- dophila MX-45 (GenBank 登錄號: DQ304536); P. rub: P. rubrum (GenBank 登錄號: CQ765963); P. dis: P. dispersa UQ68J (Gen- Bank 登錄號: AY223549);“325RLDRD329”基序用下劃線顯示Figure 2 Amino acid sequence alignment of SIsNote: E. rha: E. rhapontic (GenBank accession number: AY223550); K. sp: Klebsiella sp. LX3 (GenBank accession number: AY040843); P. mes: P. mesoacidophila MX-45 (GenBank accession number: DQ304536); P. rub: P. rubrum (GenBank accession number: CQ765963); P. dis: P. dispersa UQ68J (GenBank accession number: AY223549); The“325RLDRD329”motif is underlined低溫誘導(dǎo)，采用 Ni 金屬螯合柱純化分離，提純得到各突變體蛋白。用 10%變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)進(jìn)行電泳檢測，SDS-PAGE 圖譜顯示(圖3)，提純的重組野生型 SI 蛋白與其它 5 個(gè)突變體蛋白樣品1.2 突變體的構(gòu)建和表達(dá)在我們前面的研究中，通過 PCR 從大黃歐文氏 菌 NCPPB 1578 中克隆得到了不包括信號肽序列的1091 803 bp 的大黃歐文氏菌的 SI 基因，并以pQE30為表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了 SI 基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中的可溶性高效表達(dá)(周興等, 2011)。本研究以重組表達(dá)質(zhì)粒 pQE30-SI 為模板，通過 PCR 定點(diǎn)突變方法，分別構(gòu)建 R325D、R328A、R328D、R328Q 和 D329N 5 個(gè) 突變體。所有突變體均進(jìn)行 DNA 測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)相一致。突變體表達(dá)質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主 E. coli M15 中，經(jīng) 10 mol/L 超低濃度IPTG (iso propyl- -D-thiogalactopyranoside) 和 28均在約 60 kD 處出現(xiàn)濃度較一致的單一蛋白條帶，表明突變沒有導(dǎo)致突變體蛋白分子量大小以及其表達(dá)水平發(fā)生明顯的變化。1.3 突變對產(chǎn)物組成和酶學(xué)特性的影響對所構(gòu)建的突變體蛋白進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的測 定，結(jié)果顯示( 表 1)：在第 325 位氨基酸殘基位點(diǎn) (Arg325)和第 328 位氨基酸殘基位點(diǎn)(Arg328)，以帶負(fù)電 荷側(cè)鏈的天冬氨酸殘基(Asp, D)替代帶正電荷側(cè)鏈表 1 突變體轉(zhuǎn)化蔗糖的活力及產(chǎn)物組成Table 1 Product composition of sucrose conversion by the mutants and the mutants enzyme kinetics酶Enzyme異麥芽酮糖含量(%)Isomaltulose content (%)海藻酮糖含量(%)Trehalulose content (%)其它 a (%)Others a (%)比活力(U/mg)Specific activity(U/mg)相對活力(%)Relative activity (%)Glu+Fru(%)Iso/TreratioKm(mmol/L)野生型Wild-type R325D R328A R328D R328Q D329NND b83.8346.866.710013.765.259.666.982.814.219.323.319.912.267.715.514.313.25.04.4ND2.8ND ND0.963.382.563.366.7988.7107.689.1220.3116.87.916.910.411.67.911.825.315.517.411.8注: Glu+Fru: 葡萄糖+果糖; Iso/Tre: 異麥芽酮糖 / 海藻酮糖; a 其它: 未知寡糖; b ND: 未檢測到Note: Glu+Fru: Glucose+fructose; Iso/Tre: Isomaltulose/trehalulose; a Others: Undetermined oligosaccharides; b ND: Not detected圖 3 SI 及其突變體的 SDS-PAGE 檢測注: M: 蛋白質(zhì) Marker; 泳道 16: SI, R325D, R328A, R328D, R328Q和 D329NFigure 3 SDS-PAGE of SI and its mutantsNote: M: Protein Marker; Lane 16: SI, R325D, R328A, R328D, R328Qand D329N的精氨酸殘基(Arg, R)，所構(gòu)建突變體 R325D 和 R328D的 Km 值接近野生型 SI 的 2 倍；在 Arg328 位點(diǎn)突變 為帶非極性側(cè)鏈的丙氨酸殘基(Ala, A)，其 Km 值升 至野生型 SI 的 2.3 倍，而同一位點(diǎn)突變?yōu)椴粠щ姾?極性側(cè)鏈的谷氨酰胺殘基(Gln, Q)，其 Km 值上升至 接近野生型 SI 的 5 倍；Asp329 氨基酸殘基突變?yōu)樘?冬酰胺殘基(Asn, N)，是相對保守的突變，突變體 D329N 的 Km 值達(dá)到野生型 SI 2.5 倍。對突變體的比活 力測定顯示，所構(gòu)建的 5 個(gè)突變體的比活力均劇烈下 降，其相對比活力達(dá)到野生型的 11.8%25.3%。以蔗糖為底物，加入突變體蛋白進(jìn)行反應(yīng)。采用 高效液相色譜(HPLC)分析對反應(yīng)產(chǎn)物中的糖組份進(jìn) 行檢測。HPLC 分析圖譜顯示(圖 4)，SI 及其突變體轉(zhuǎn) 化蔗糖的產(chǎn)物中，除底物蔗糖外，均出現(xiàn)與異麥芽酮糖、葡萄糖和果糖標(biāo)樣滯留時(shí)間相同的峰；突變體R325D 和 R328D 產(chǎn)物中還出現(xiàn)了一個(gè)滯留時(shí)間比蔗圖 4 SI 及其突變體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的 HPLC 檢測注: 圖 AF: SI, R325D, R328A, R328D, R328Q, D329N; 1: 果糖; 2: 葡萄 糖; 3: 蔗糖; 4: 異麥芽酮糖; 5 海藻酮糖; 6: 未知寡糖Figure 4 HPLC analysis of the composition of products converted by SI and its mutantsNote: AF: SI, R325D, R328A, R328D, R328Q, D329N; 1: Fructose; 2: Glucose; 3: Sucrose; 4: Isomaltulose; 5: Trehalulose; 6: Undeter-mined oligosaccharide基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)Genomics and Applied Biology560糖、異麥芽酮糖及海藻酮糖這些二糖滯留時(shí)間更長的產(chǎn)物，該化合物初步斷定為未知結(jié)構(gòu)的寡糖。通過 比較這些組份的峰面積，結(jié)果顯示( 表 1)：Arg325 和 Arg328 分別突變?yōu)閹喾措姾蓚?cè)鏈的 Asp，導(dǎo)致產(chǎn)物 中異麥芽酮糖 / 海藻酮糖的比例變化最大，從野生型 蛋白的 6.93 分別降至 0.96 和 2.92，并且 突 變 體 R325D 反應(yīng)產(chǎn)物中海藻酮糖含量超過了異麥芽酮糖 含量。突變體 R328A 和 R328Q 的反應(yīng)產(chǎn)物中異麥芽酮 糖與海藻酮糖比例下降幅度較一致，分別為 3.38 和3.36；但 Asp329 突變?yōu)?Asn 沒有導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物中異麥 芽酮糖與海藻酮糖比例發(fā)生改變。表 1 結(jié)果還顯示： 在 R325D、R328A、R328D 和 R328Q 突變體反應(yīng)產(chǎn)物中，異 麥芽酮糖與海藻酮糖比例下降的同時(shí)，水解產(chǎn)物葡萄糖和果糖的比例上升，R325D 達(dá)到最高(66.7%)，說 明這些突變導(dǎo)致了 SI 的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷活性下降而 水解活性上升。(325RLDRD329)基序?yàn)檠芯繉ο螅瑯?gòu)建了 R325D、R328A、R328D、R328Q 和 D329N 5 個(gè)突變體。所測定 5 個(gè)突變體的 Km 值上升、其比活力下降，結(jié)果與 Zhang 等(2003b)對克雷伯氏菌 LX3 的 PalI 研究結(jié)果相類似。表明控制產(chǎn)物特異性基序中 R325、R328 和 D329 3 個(gè)帶電氨基酸殘基對 SI 的酶活具有重要作用。本研究對 各突變體轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)物中糖組分的分析結(jié)果則表明，除 D329N 突變體外，其它 4 個(gè)突變轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)物中，異麥芽酮糖的比例下降，而海藻酮糖比例上升。說明這些位點(diǎn)的突變對 SI 的產(chǎn)物特異性產(chǎn)生影響。但 本 研究測定出的糖組分變化幅度與 Zhang 等(2003b)的結(jié)果存在較大差異。Zhang 等構(gòu)建的 D329N突變體產(chǎn)物中異麥芽酮糖的含量從 82.8% 降 至30.4%，而海藻酮糖的含量則從 12.1%上升至 66.8%。本研究構(gòu)建的 D329N 突變體的轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)物的各糖組分的比例與野生型蛋白相比基本沒有變化(兩者含 量分別為 82.8%和 12.2%)。Zhang 等構(gòu)建的 R325D 突 變體產(chǎn)物中異麥芽酮糖和海藻酮糖含量分別為 15.8% 和 55.7% ，本研究的 R325D 突變體分別只有13.7%和 14.2%，并且蔗糖水解產(chǎn)物葡萄糖和果2 討論序列比對和結(jié)構(gòu)分析表明 SI 屬于糖苷水解酶(glycoside hydrolase) 家族 13 的新成員(Zhang et al.,2003a)。不同來源的 SI 轉(zhuǎn)化蔗糖的產(chǎn)物中，異麥芽酮 糖與海藻酮糖含量的比例迥異。如來源于分散泛菌UQ68J 的 SI 的蔗糖反應(yīng)產(chǎn)物中，異麥芽酮糖含量達(dá) 到 91%，海藻酮糖只有 3% (Wu and Birch, 2005)；而嗜溫嗜酸假單胞菌 MX-45 的 SI 的蔗糖反應(yīng)產(chǎn)物中，兩者比例恰恰相反，異麥芽酮糖含量只有 8%，海 藻酮糖卻高達(dá) 91% (Miyata et al., 1992)。同時(shí)值得注意的是：同屬于 SI 的異麥芽酮糖合成酶和海藻酮糖合成酶的氨基酸序列具有很高的同源性(圖 2)。如何 從這些酶的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的細(xì)小差異上解釋這一現(xiàn)象？Zhang 等(2003b)基于序列比對和突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出以異麥芽酮糖為主要產(chǎn)物的 SI 均具有保 守的 325RLDRD329 基序，該基序控制了產(chǎn)物特異性；而以海藻酮糖為主要產(chǎn)物的嗜溫嗜酸假單胞菌 MX-45 的 SI 相應(yīng)的序列不同，其序列為 311RYDRA315。A- roonnual 等(2007)通過點(diǎn)突變方法，突變了肺炎克雷伯氏菌 NK 33-98-8 (Klebsiella pneumoniae NK 33-98-8)的 SI (異麥芽酮糖為主產(chǎn)物)的產(chǎn)物特異性基 序，他們的結(jié)果表明，突變體 L326Y 和 D329A 并沒有導(dǎo)致產(chǎn)物中異麥芽酮糖含量的下降及海藻酮糖含量的上升，只是酶比活分別下降了 2 倍和 6 倍；而將該基 序整個(gè)突變?yōu)槭葴厥人峒賳伟?MX-45 的 SI (海藻 酮糖為主產(chǎn)物)的 311RYDRA315 序列，不但產(chǎn)物的比例 沒有變化，其酶比活力還下降了 24 倍之多。本研究以大黃歐文氏菌 SI 的控制產(chǎn)物特異性糖的含量高達(dá) 66.7%，表現(xiàn)出極強(qiáng)的蔗糖水解活性。本研究的 R328D 突變體產(chǎn)物中異麥芽酮糖和海藻酮糖含量分別為 59.6%和 23.3%，而 Zhang 等構(gòu)建的 R328D 突變體轉(zhuǎn)化蔗糖結(jié)果為 19.2%和 73.3%。以上 結(jié)果對比表明大黃歐文氏菌 SI 的控制產(chǎn)物特異性基序?qū)Ξa(chǎn)物特異性的影響并沒有像克雷伯氏菌 LX3 的 PalI 那樣顯著，可能該基序并不是影響大黃歐文氏菌 SI 產(chǎn)物特異性的單一因素。對大黃歐文氏菌 SI 的控 制產(chǎn)物特異性研究，或許還需要尋找到其它位點(diǎn)。3 材料與方法3.1 供試材料所用菌株和質(zhì)粒的特征及來源見表 2。所有大腸 桿菌克隆均用 Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需 要加入所需濃度的抗生素：構(gòu)建突變體時(shí)，LB 培養(yǎng)基加入氨芐青霉素至終濃度 50 mg/L；重組蛋白表達(dá)時(shí)，LB 培養(yǎng)基加入氨芐青霉素至終濃度 100 mg/L。異麥芽酮糖、蔗糖、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)糖分子樣 品購自 Sigma 公司(海藻酮糖無標(biāo)樣)。3.2 突變體構(gòu)建定點(diǎn)突變的模板為重組質(zhì)粒 pQE30-SI。PCR 反 應(yīng)體系 50 L，擴(kuò)增酶為大連寶生物公司的 PrimeS- TARTM HS DNA Polymerase，突變體引物見表 3。擴(kuò)增表 2 供試菌株與質(zhì)粒Table 2 Bacterial strains and plasmids used in this study菌株與質(zhì)粒Strain or plasmid特征Characterization來源Source大腸桿菌 XL10-GoldE. coli XL10-Gold大腸桿菌 M15E. coli M15 pQE30克隆宿主Cloning host 表達(dá)宿主 Expression host 大腸桿菌表達(dá)載體E. coli expression vector質(zhì)粒 pQE30 中克隆有 SI 基因 1091 803 bp 序列片段pQE30 containing coding region of SI from nucleotides 109 to 1 803質(zhì)粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 325 位精氨酸殘基突變?yōu)樘於彼釟埢鵄rg residue at 325 in SI replaced by Asp in pQE30-SI質(zhì)粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 328 位精氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢鵄rg residue at 328 in SI replaced by Ala in pQE30-SI質(zhì)粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 328 位精氨酸殘基突變?yōu)樘於彼釟埢鵄rg residue at 328 in SI replaced by Asp in pQE30-SI質(zhì)粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 328 位精氨酸殘基突變?yōu)楣劝滨０窔埢鵄rg residue at 328 in SI replaced by Gln in pQE30-SI質(zhì)粒 pQE30-SI 中 SI 基因的第 329 位天冬氨酸殘基突變?yōu)樘於０窔埢鵄sp residue at 329 in SI replaced by Asn in pQE30-SIStratageneQiagenQiagenpQE30-SI實(shí)驗(yàn)室保藏Laboratory collection本研究 This work 本研究 This work 本研究 This work 本研究 This work 本研究 This workpQE-R325DpQE-R328ApQE-R328DpQE-R328QpQE-D329N表 3 突變體引物序列 aTable 3 Primers sequences used in site-directed mutagenesis aSDS-PAGE 檢測，有正常的目的表達(dá)帶的菌株為候選菌株。劃線分離后，由上海生工公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。3.3 重組蛋白的表達(dá)和純化所有突變體均以 E. coli M15 為表達(dá)宿主。挑 取一個(gè)單菌落接種到含 100 mg/L 氨芐青霉素的50 mL LB 培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)至 OD600 0.6 左右；按1%接種量接種至 500 mL 的含 100 mol/L 氨芐青霉 素的 LB 培養(yǎng)基，繼續(xù)在 37振蕩培養(yǎng)至 OD600 0.6，加入 IPTG 至終濃度 10 mol/L，28誘導(dǎo)過夜。離心收 集誘導(dǎo)的菌體，冰浴超聲破碎上樣緩沖液(20 mmol/L咪唑, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L, pH 6.0 磷酸鹽)重新 懸浮菌體。破碎后的菌體上清液過 Ni 金屬螯合柱，以80 mmol/L 咪唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L (pH 6.0)磷酸鹽緩沖液洗雜蛋白，最后收集 200 mmol/L 咪唑洗 脫的蛋白峰。純化蛋白用 10% SDS-PAGE 分析。蛋白濃 度用 Bradford 法測定，牛血清白蛋白為蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)。3.4 蔗糖的體外轉(zhuǎn)化200 L 反應(yīng)液體系由 400 mmol/L 蔗糖加 1020 g 蛋白組成，蔗糖和蛋白均用 50 mmol/L 磷酸鹽(pH 6.0)溶解。加入蛋白混勻后立即放入 30水浴鍋突變體Mutant引物序列(5-3)Primer sequence (5-3)R325DR328A R328D R328QD329NGTTTGATCTGATCGATCTCGATCGTGATGGATCAGGCTCGATGCTGATGCTGATG GATCAGGCTCGATGATGATGCTGATG GATCAGGCTCGATCAAGATGCTGATG GCTCGATCGTAATGCTGATGAAAG注: a 只顯示正向引物序列; 反向引物與正向引物序列完全配對; 下劃線顯為突變位點(diǎn)Note: a Only the sequences of forward primers are shown; The se- quences of reverse primers for each mutant are complementary to those of its forward primers; The nucleotides underlined indicat-ed the sites of mutation條件：95 1 min，98 15 s，5054 30 s，72 6 min，25 個(gè)循環(huán)后，72 繼續(xù)延伸 10 min。 PCR 產(chǎn)物用 Dpn 消化過夜，去除模板 DNA 后，取 5 L 用熱激 法轉(zhuǎn)化到 E. coli XL10-Gold 后，涂布在加有氨芐青霉 素(50 mg/L)的 LA 平板上。37培養(yǎng) 12 h 以上，從平 板中挑取單菌落接種到 5 mL LB 培養(yǎng)液中，37培養(yǎng) 至菌液略顯渾濁，取 0.2 mL 菌液，加入 IPTG 至終濃 度 0.5 mmol/L，28誘導(dǎo)表達(dá) 4 h，離心收集菌體，用反應(yīng)，水浴 1030 h 后置于沸水浴中 5 min 終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用 HPLC 檢測?；蚪M學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)Genomics and Applied Biology5623.5 糖的分析還原糖的定量分析采用水楊酸(DNS) 法。 取95 L 蔗糖(終濃度 200 mmol/L)，加入 25 L 酶液，迅 速混勻后于 30水浴中保溫 30 min，取出并立即加入180 L DNS 溶液終止反應(yīng)，沸水浴 5 min。以葡萄糖 為還原糖標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用酶標(biāo)儀測定 540 nm波長處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)產(chǎn)物中 還原糖的量，并計(jì)算酶活力。酶活力單位定義為：在上述分析條件下，每分鐘催化形成相當(dāng)于 1 mol 葡 萄糖的還原糖所需的酶量為 1 個(gè)活力單位。糖組份的分析采用 HPLC 法。儀器為 Waters600，檢測器為 Waters 2414 示差檢測器，分析柱為 Wa- ters 的高效碳水化合物分析柱(4.6 mm250 mm, 4 m)， 流動相為乙腈:水，80:20 (v/v)，以 1 mL/min 恒定流量 洗脫。積分得到各組分的峰面積，并由此計(jì)算出各組分的相對百分比(relative percentage)。3.6 SI 及其突變體的 Km 測定反應(yīng)溫度為 30，緩沖液為 50 mmol/L 磷酸鹽 (pH 6.0)緩沖液。以 560 mmol/L 不同濃度的蔗糖為 底物，DNS 法測定單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖量， 計(jì)算出反應(yīng)的初速度。重復(fù)測定 3 次，取平均值為最 后結(jié)果。最后根據(jù) Lineweaver-Burk 作圖法計(jì)算得出 重組 SI 及其突變體的 Km 值。isoma ltulose-synthesizing enzyme from Erwinia rhapontici,Biochem. 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