密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 應(yīng)用 術(shù)抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的研究 of NA 交日期 2006 年 6 月 博士研究生: 賀云霞 指導(dǎo)教師:童光志 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類(lèi)別 : 農(nóng)學(xué)博士 專(zhuān) 業(yè):預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 研究方向:動(dòng)物病毒分子 生物學(xué) 培養(yǎng)單位:研究生院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 of NA 2006 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果， 也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。 與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 （保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議） 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 論文評(píng)閱人、答辯委員名單 論文題目 應(yīng)用 術(shù)抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的研究 論文作者 賀云霞 指導(dǎo)教師 童光志 培養(yǎng)單位 哈爾濱獸醫(yī)研究所 姓名 職稱(chēng)職務(wù) 導(dǎo)師類(lèi)別 單位 專(zhuān)業(yè) 周繼勇 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 錢(qián)愛(ài)東 教授 博導(dǎo) 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 評(píng) 閱 人 吳東來(lái) 研究員 博導(dǎo) 哈爾濱獸醫(yī)研究所 答辯 主席 崔玉東 教授 博導(dǎo) 八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 崔玉東 教授 博導(dǎo) 八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 王君偉 教授 博導(dǎo) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 李一經(jīng) 教授 博導(dǎo) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 劉長(zhǎng)明 研究員 博導(dǎo) 哈爾濱獸醫(yī)研究所 周建華 研究員 博導(dǎo) 哈爾濱獸醫(yī)研究所 仇華吉 研究員 博導(dǎo) 哈爾濱獸醫(yī)研究所 答 辯 委 員 陳洪巖 研究員 博導(dǎo) 哈爾濱獸醫(yī)研究所 答辯時(shí)間與地址 2006 年 6 月 16 日 哈爾濱獸醫(yī)研究所學(xué)術(shù)報(bào)告廳 記錄人員 周艷君 I 摘 要 豬繁殖與呼吸綜合征（ 以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難為特征的、嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染性疾病之一，給世界范圍的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。 毒（ 宿主淋巴細(xì)胞有嚴(yán)格嗜性，其 因組易變異，常規(guī)的疫苗設(shè)計(jì)策略難以產(chǎn)生理想的免疫效果，因此，探索防治該病的新方法有重要意義。 為新的有效抗病毒工具，其機(jī)制與建立在病毒蛋白基礎(chǔ)上的傳統(tǒng)的疫苗免疫機(jī)制不同，是轉(zhuǎn)錄后 平上的基因沉默機(jī)制，通過(guò)雙鏈 子阻斷或者降低同源基因的表達(dá)而達(dá)到抗病毒復(fù)制的效果。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中， 21 23小干擾 以誘導(dǎo)同源基因特異表達(dá)抑制，為探索抗病毒研究提供了新思路。 本研究首先針對(duì) 含量最高、相對(duì)保守的核衣殼蛋白（ N）編碼序列 因，使用 ，選取 4 個(gè)特異 列（ ，同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)無(wú)相關(guān)序列（ 照，利用一步 6 啟動(dòng)子的發(fā)夾 達(dá)盒（ ，帶 達(dá)盒的 蛋白的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，熒光顯微鏡下檢測(cè)表達(dá)綠色熒光蛋白（ 胞比例，快速篩選有效 段。篩選 93T 細(xì)胞系，驗(yàn)證了篩選片段的基因沉默效果，在 染的 段可以明顯減輕 起的特異性細(xì)胞病變。 為了使 得長(zhǎng)久表達(dá)并適合于大量制備，將 制備 達(dá)盒插入到粒載體，構(gòu)建 達(dá)載體（ ，轉(zhuǎn)染 胞，在 平及蛋白質(zhì)水平檢測(cè) 制的抑制。結(jié)果證明 以明顯減輕 起的特異性細(xì)胞病變；在間接免疫熒光分析（ 測(cè)中，理細(xì)胞的 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞及 N 蛋白表達(dá)量比對(duì)照的明顯減少；熒光定量 病毒滴定檢測(cè)發(fā)現(xiàn) 理細(xì)胞中 N 蛋白的 對(duì)照減少了 96%，病毒滴度比對(duì)照減少了 681 倍。此外， 檢測(cè) 制 次要結(jié)構(gòu)蛋白的 達(dá)水平的變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，次要結(jié)構(gòu)蛋白 達(dá)水平分別比對(duì)照減少了 60%、 30%、 55%，證明 復(fù)制受到了抑制，而且 抑制作用是特異的。 為了了解次要結(jié)構(gòu)蛋白 針對(duì)各基因分別選取 4個(gè) 建相應(yīng)的 達(dá)載體（ 21、 22、 23、 24、 31、 32、 33、 34、 41、 42、 43、 44） 。 染 胞中 應(yīng) 量的特異 毒效價(jià)滴定表明這些 達(dá)載體（ 23、 24、 31、 34、 41）處理細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度比對(duì)照低 84 倍，但 測(cè)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異，推測(cè)次要結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中有重要作用。 研究為 術(shù)應(yīng)用于抗 染研究奠定了基礎(chǔ)并為研究病毒蛋白功能提供了新途徑。 關(guān)鍵詞 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 , 擾 , 干擾性小 短發(fā)夾 is by a of of It is of of to NA is to As a a is on of It is a of by In (21of It a in In a A as by a as by 6 by of 93T of on an In 93T of on in In to at It in In In it 6% of 81of in a In of It of P4)0%, 30% 5%, It of In to P4 in 21, 22, 23, 24, 31, 32, 33, 34, 41, 42, 43 4). of of 23, 24, 31, 34 1) 84 of no It a a to of of V 目 錄 第一章 緒論 .究進(jìn)展 . 1 . 染的細(xì)胞生物學(xué) . 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯 . 復(fù)制酶蛋白 . 主要結(jié)構(gòu)蛋白 . 次要結(jié)構(gòu)蛋白 . 免疫抑制和持續(xù)性感染 . 細(xì)胞凋亡與 病的關(guān)系 . 11 準(zhǔn)種、異常 病的關(guān)系 .0 防制策略 .究進(jìn)展 . 14 述 . 分子機(jī)制 . 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特殊的 象 . 應(yīng)用 . 局限性及應(yīng)用前景 .研究的目的和意義 . 24 第二章 基于 增的 達(dá)盒快速篩選 蛋白特異的有效 列 .料與方法 . 26 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒 . 試劑、抗體 . 主要儀器 . 篩選和 達(dá)盒的設(shè)計(jì) . 達(dá)盒的擴(kuò)增和純化 . 表達(dá) 合蛋白載體的構(gòu)建 . 病毒 . 用 染 293T 細(xì)胞 . 合蛋白穩(wěn)定表達(dá) 293T 細(xì)胞系的篩選 .0 染 感染 .1 間接免疫熒光法檢測(cè) 抑制 .果 . 31 一步 擴(kuò)增 達(dá)盒 . 計(jì)算病毒滴度 . 組質(zhì)粒的鑒定 . 制 合蛋白的表達(dá) . 定表達(dá)細(xì)胞系上的效果 . 制了 異性細(xì)胞病變的產(chǎn)生 . 少 染細(xì)胞中的 N 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞 .論 . 35 第三章 基于載體表達(dá)的 胞上對(duì) 制抑 的研究 .料與方法 . 38 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒 . 試劑、抗體 . 主要儀器 . 引物探針設(shè)計(jì) . 達(dá)載體的構(gòu)建 . 達(dá)載體的純化 . 達(dá)載體的轉(zhuǎn)染 . 測(cè) 達(dá)載體對(duì) 制的抑制 . 測(cè) N 蛋白表達(dá)變化及抑制作用的劑量依賴(lài)性 .0 熒光定量 測(cè)抑制效果 .1 毒價(jià)滴定檢測(cè)抑制效果 .果 . 44 達(dá)盒的擴(kuò)增和 達(dá)載體的構(gòu)建 . 達(dá)載體抑制 起的特異性細(xì)胞病變 . 達(dá)載體減少 性細(xì)胞 . 達(dá)載體在蛋白水平減少 N 蛋白表達(dá) . 達(dá)載體在 平減少 N 蛋白表達(dá) . 達(dá)載體對(duì)病毒毒價(jià)的影響 .論 . 51 第四章 特異 篩選及其抑制效果的研究 .料與方法 . 57 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒 . 試劑 . 儀器 . 擴(kuò)增及克隆載體的構(gòu)建 . 針及引物的設(shè)計(jì) . 選及 達(dá)盒設(shè)計(jì) . 達(dá)載體的構(gòu)建 . 達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及病毒的感染 . 熒光定量 測(cè)抑制效果 .0 病毒毒價(jià)滴定檢測(cè)抑制效果 .果 . 60 擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建 . 擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定 . 達(dá)載體抑制 異性細(xì)胞病變 . 熒光定量 測(cè) 表達(dá)變化 . 病毒毒價(jià)滴定結(jié)果 .論 . 65 第五章 結(jié)論 .考文獻(xiàn) . 謝 .者簡(jiǎn)歷 .表清單 圖 1因組結(jié)構(gòu)及亞基因組 . 1非結(jié)構(gòu)蛋白剪切方案 . 1其它動(dòng)脈炎病毒的 基因組中的相應(yīng)位置 . 1-4 特征及 作用機(jī)制 . 1放大機(jī)制 . 1-6 作用途徑 . 1 起非特異性基因沉默的途徑 .