密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 茶樹查爾酮異構(gòu)酶、黃酮醇合成酶和無色花色素還原酶等基因的克隆與表達(dá)分析 碩 士 研 究 生：馬春雷 指 導(dǎo) 教 師：陳 亮 申請(qǐng)學(xué)位類別：碩 士 專 業(yè)：茶 學(xué) 研 究 方 向：分子生物學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：茶葉研究所 提交日期 2007 年 6 月 2007 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)名單表 論文題目 茶樹查爾酮異構(gòu)酶、黃酮醇合成酶 和無色花色素還原酶基因的克隆與表達(dá)分析 論文作者 馬春雷 專 業(yè) 茶學(xué) 研究方向 分子生物學(xué)指導(dǎo)教師 陳亮 培養(yǎng)單位（研究所） 茶葉研究所 姓名 職稱 碩 （博）導(dǎo)師 單 位 專 業(yè) 簽 名 張志芳 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 分子生物學(xué) 評(píng) 閱 人 梁月榮 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 茶樹分子生物學(xué) 答辯 主席 朱誠 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物分子生理學(xué) 梁月榮 教授 博導(dǎo) 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 茶樹分子生物學(xué) 成浩 研究員 博導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 茶學(xué) 魯成銀 研究員 碩導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 茶學(xué) 江和源 副研究員 碩導(dǎo) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 茶學(xué) 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 答 辯 委 員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 會(huì)議記錄（秘書） 楊珍偉 論文答辯時(shí)間地點(diǎn) 2007 年 6 月 15 日，杭州 本研究受 國家 863 計(jì)劃項(xiàng)目(2006浙江省“ 錢江人才” 計(jì)劃 (2006人事部和教育部留學(xué)回國人員科研基金(2005005資助 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 卞青霉素 苷三磷酸 基對(duì) 碳酸二乙酯 化乙錠 達(dá)序列標(biāo)簽 丙基硫代- B 培養(yǎng)基 pI 電點(diǎn) 密度 合酶鏈反應(yīng) 丙氨酸解氨酶 爾酮合成酶 爾酮異構(gòu)酶 氫黃酮醇 4酮醇合成酶 色素還原酶 青素合成酶 色花色素還原酶 哚- of 端快速擴(kuò)增技術(shù) 摘 要 茶葉是世界上最流行的無酒精健康飲品之一，含有許多有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物，如類黃酮、咖啡堿等。其中類黃酮是由類苯基丙烷等前體縮合而成一組天然化合物，它們?cè)谥参锏纳L、發(fā)育和防御疾病等方面有著重要作用。而且，這些化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)于改善人體健康的效果也非常突出。因此，分離克隆茶樹類黃酮生物合成途徑中相關(guān)酶的基因具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。主要研究結(jié)果如下： 1. 在原有茶樹礎(chǔ)上，利用 因的全長序列，其在登錄號(hào)是序列全長 1 163 中開放閱讀框長 723 碼 240 個(gè)氨基酸，3 端有一個(gè)明顯的多聚腺苷酸加尾信號(hào)，推測(cè)的蛋白分子量約為 26.4 kD， 列分析表明它在登錄的植物中與番茄2. 根據(jù)原有 計(jì)引物，利用 術(shù)獲得了茶樹黃酮醇合成酶（基因全長序列，在 錄號(hào)為 序列全長 1 317 中開放閱讀框長 996 碼 331個(gè)氨基酸， 3端有一個(gè)明顯的多聚腺苷酸加尾信號(hào)，推測(cè)的蛋白分子量約為 37.5 列分析表明它在 登錄的植物中與葡萄 因序列的親緣關(guān)系比較近。將該基因重組到表達(dá)載體 )中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng) 導(dǎo)、 測(cè)，結(jié)果表明茶樹黃酮醇合成酶基因能在大腸桿菌 表達(dá)，電泳檢測(cè)到一條大約 61外源蛋白，與預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量相符。 3. 利用 3術(shù)獲得了茶樹無色花色素還原酶（的 3端，將其與原有 段拼接，得到了 因的全長序列，其在 登錄號(hào)為 序列全長 1 301 中開放閱讀框長 1 029 碼 342 個(gè)氨基酸， 3端有一個(gè)明顯的多聚腺苷酸加尾信號(hào)，推測(cè)的蛋白分子量約為 37.5 同源性分析表明得到的洋莓（葡萄（的氨基酸序列相似性分別為70、68、71。十種植物的聯(lián)配表明其氨基酸序列較為保守。 4. 利用半定量 術(shù)檢測(cè)了類黃酮的主要成分兒茶素含量不同 4 個(gè)茶樹品種中與類黃酮合成相關(guān)的查爾酮合成酶(、黃烷酮 33H) 、黃酮醇合成酶(、二氫黃酮醇4、無色花色素還原酶(、花色素還原酶(和花青素合成酶(等 7個(gè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明 因的表達(dá)量與茶樹中兒茶素含量呈一定的相關(guān)性，而其它基因則與其相關(guān)性不大。 關(guān)鍵詞 茶樹 查爾酮異構(gòu)酶 黃酮醇合成酶 無色花色素還原酶 基因克隆 原核表達(dá) I ea is in a of in of be of of of of in to of as 1. an of by ST of of 163o. a 723bp a 240 an 6.4 kD it is 2. by on ST of 317o. a 996RF a 331 an 7.5 kD it is +) in to be 1 kD by to 3. of CR AR we to AR 301o. a 1 029RF a 342 an AR of 1%, 70% 8% 4. I to of in FR AR of 目 錄 英文縮略表 . 一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 . 1 物基因克隆技術(shù) . 序列克隆 . 功能克隆 . 定位克隆 . 表型克隆 . .樹功能基因克隆進(jìn)展 . 茶多酚代謝關(guān)鍵酶基因的克隆 . 與咖啡堿合成有關(guān)酶基因的克隆 . 茶葉香氣相關(guān)基因的克隆 . 茶氨酸合成相關(guān)基因的克隆 . 茶樹中光反應(yīng)相關(guān)基因的克隆 . 茶樹中抗逆相關(guān)基因克隆 . 其它基因的克隆 . .研究的目的意義和思路 . 10 第二章 茶樹查爾酮異構(gòu)酶基因克隆及序列分析 . 12 料和方法 . 12 料 . 主要試劑和溶液 . 總. 引物設(shè)計(jì) . 合成. 單鏈. 巢式.果和分析 . 15 . . 序列同源性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) . 系統(tǒng)樹分析 .論 . 17 第三章 茶樹黃酮醇合成酶基因克隆、序列分析及原核表達(dá) . 19 料和方法 . 19 料 . 主要試劑和溶液 . 引物設(shè)計(jì) . . 隆和測(cè)序 . 原核表達(dá)引物設(shè)計(jì) . 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 . 重組質(zhì)粒的雙酶切和. 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá) .果和分析 . 25 . . 序列同源性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) . 系統(tǒng)樹分析 . 黃酮醇合成酶基因的. 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá) .論 . 30 第四章 茶樹無色花色素還原酶基因 克隆及序列分析與類黃酮合成相關(guān)七個(gè)基因表達(dá)的. 31 料和方法 . 31 料 . 主要試劑和溶液 . 引物設(shè)計(jì) . . 隆和測(cè)序 . 半定量. 基因表達(dá)的.果和分析 . 34 . 序列同源性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) . 系統(tǒng)樹分析 . 不同品種間的相對(duì)表達(dá)含量分析 .論 . 39 第五章 主要結(jié)論和展望 . 41 隆得到了茶樹查爾酮異構(gòu)酶基因 . 41 樹黃酮醇合成酶基因的克隆及其原核表達(dá) . 41 隆獲得了茶樹無色花色素還原酶基因 . 42 用半定量 . 42 V 望 . 42 參考文獻(xiàn) . 44 致 謝 . 49 作 者 簡(jiǎn) 歷 . 50 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 茶是一種由山茶科植物茶樹 L.) O. 嫩芽葉，經(jīng)不同的生產(chǎn)流程制制成的飲料。2005 年世界茶葉栽培面積已達(dá) 公頃，總產(chǎn)量 噸，直接貿(mào)易額 40多億美元() 。茶已成為栽培規(guī)模最大、產(chǎn)量最多、消費(fèi)人群最廣的飲料作物之一。 現(xiàn)代研究表明，茶葉富含黃酮類、生物堿類和其他許多重要的次生代謝物質(zhì)，它們對(duì)人體有重要的生理保健作用，如防齲齒、抗菌抗病毒抗氧化、降血壓降血脂降膽固醇、抗癌抗突變等(et 1998; et 1994)。因此，從茶葉中提取有效成分加工制成醫(yī)藥和保健品已成為茶樹綜合利用的重要方向。而品種對(duì)茶葉的質(zhì)量至關(guān)重要，隨著茶葉市場(chǎng)向多元化發(fā)展，優(yōu)良茶樹品種供不應(yīng)求。因而，采用生物技術(shù)改良或培育新一代茶樹品種已成為國內(nèi)外茶學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。茶樹同大多數(shù)植物一樣，其生長發(fā)育是在多種代謝和生理過程基礎(chǔ)上所發(fā)生的基因在時(shí)空上表達(dá)的綜合現(xiàn)象，開發(fā)和分離各種有潛在價(jià)值的基因并深入研究其機(jī)理，將為從分子水平調(diào)控茶樹的生長、發(fā)育和代謝，并為茶樹的遺傳改良打下基礎(chǔ)。 物基因克隆技術(shù) 基因克隆就是利用體外重組技術(shù)將特定的基因和其它序插入到載體分子中進(jìn)行擴(kuò)增，它是隨70年代初外重組技術(shù)發(fā)展起來的，經(jīng)過30 多年的發(fā)展，已經(jīng)形成了一些比較成熟的方法，主要有序列克隆、功能克隆、定位克隆和表型克隆等。 列克隆 序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列時(shí)采用的方法。目前很多植物基因序列已知，當(dāng)要克隆類似基因時(shí)可先從 中找到有關(guān)基因的序列，設(shè)計(jì)特異引物，用 方法克隆不同植物的基因。這是 術(shù)誕生后出現(xiàn)的一種快速、簡(jiǎn)便克隆植物基因的方法。有時(shí)要從其他的種、屬中克隆同源基因時(shí)，可以先比較序列已知的基因序列，尋找比較保守的區(qū)域，根據(jù)此區(qū)域的序列設(shè)計(jì)并合成探針，然后從 庫或者基因組文庫中篩選到目的基因的克隆。茶樹中很多基因，包括苯丙氨酸解氨酶( 查爾酮合酶( 多酚氧化酶( 都是以這種方法克隆的(et 1994; et 1994; 趙東等，2001) 。 能克隆 功能克隆與序列克隆不同，它是在目的基因序列未知的情況下，先對(duì)其編碼產(chǎn)物的生理生化及代謝途徑進(jìn)行研究，然后根據(jù)得到的信息克隆基因的方法。根據(jù)克隆基因的原理又可分為兩條路線，一條是分離純化已知的蛋白質(zhì)或多肽，制備該蛋白的特異抗體，利用標(biāo)記的特異蛋白抗體作為探針篩選由表達(dá)型載體建立的基因組文庫或者 庫，并最終克隆目的基因；第二條路1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 線是將蛋白質(zhì)純化后測(cè)定其氨基酸序列，根據(jù)蛋白質(zhì)密碼子編碼規(guī)律和密碼子偏愛原則，反向推算出 列，然后據(jù)此人工合成一段寡核苷酸作探針，利用同位素或其它方法標(biāo)記后篩選一般的基因組文庫或 庫，篩選陽性重組克隆，并最終克隆目的基因。 周兆斕等(1996) 構(gòu)建水稻 庫，根據(jù)水稻巰基蛋白酶 列，合成探針篩選 隆了水稻巰基蛋白酶抑制劑 基蛋白酶抑制劑是一類天然抗蟲物質(zhì)，將它轉(zhuǎn)化可能獲抗蟲譜廣，抗蟲性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。 (1990)也用這種方法從煙草中克隆了兩種酸性病原相關(guān)蛋白(簡(jiǎn)稱 白)基因。功能克隆只要知道目的基因表達(dá)的產(chǎn)物即可，屬于表型克隆范疇，但目前大多數(shù)基因產(chǎn)物還不清楚，即使知道了，要純化到可供氨基酸測(cè)序及抗體制備的蛋白質(zhì)也很困難，同時(shí)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，很難推導(dǎo)出十分特異的探針，所以大多數(shù)基因難以用這一方法予以克隆。 位克隆 定位克隆是在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選 庫，從而構(gòu)建包含目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步移逐步逼近目的基因或通過染色體登陸技術(shù)最終克隆目的基因的方法。它是克隆編碼產(chǎn)物未知基因的一種有效方法。定位克隆技術(shù)依賴于高密度的分子標(biāo)記圖譜。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們已經(jīng)獲得了許多高密度的遺傳圖譜，例如水稻已有 3627 個(gè)分子標(biāo)記的圖譜，覆蓋基因組的 1530.4 隨著對(duì)目的基因的精細(xì)定位，同時(shí)構(gòu)建大尺度的物理圖譜，該技術(shù)的應(yīng)用將更加廣泛。 定位克隆技術(shù)對(duì)于基因組較小，重復(fù)序列少而且已經(jīng)構(gòu)建了高密度限制性片段長度多態(tài)性( 或隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(等標(biāo)記圖譜植物無疑是有效的，如擬南芥和番茄，但對(duì)象小麥、玉米等具有大型基因組而且重復(fù)序列高，又難于構(gòu)建高密度分子標(biāo)記圖譜的糧食作物來說，卻很困難。除此之外定位克隆技術(shù)需要尋找與目標(biāo)基因座位連鎖的遺傳標(biāo)記或部分功能信息。有時(shí)需連鎖作圖，較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在植物的基因組中，大量存在 復(fù)序列經(jīng)常是染色體步移難以逾越的障礙。 型克隆 表型克隆是與定位克隆相對(duì)的一種克隆基因的策略，它可對(duì)因突變而導(dǎo)致的某一特殊表型的目的基因直接進(jìn)行克隆分析并分離該基因，而不必事先知道其生化功能及在染色體上的精確位置，也不需知道假設(shè)基因的數(shù)目或其作用方式，常見的表型克隆方法有轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)(、消減雜交(、 別顯示技術(shù) (鳥槍克隆法等。其中應(yīng)用價(jià)值較高的是轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、鳥槍克隆法和異顯示技術(shù)。 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究思路 端快速擴(kuò)增技術(shù) 隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的深入研究，對(duì)基因的結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)的研究越來越成為后基因組計(jì)劃中的研究熱點(diǎn)，而這些研究都是以分離和克隆目的基因?yàn)榛A(chǔ)的。目前在實(shí)驗(yàn)工作中，我們要得到某基因的片段、全長或近全長 了上面介紹的幾種主要方法外，近幾年發(fā)展起來的 端快速擴(kuò)增技術(shù)(of 憑借其快捷、方便等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到研究人員的青睞。由 (1988) 發(fā)明的一項(xiàng)新技術(shù)，由 術(shù)發(fā)展而來，也被稱為錨定 單邊 是一種應(yīng)用特異引物和通用引物從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增已知 段旁側(cè) 3和 5末端的簡(jiǎn)單而有效的方法，具有快捷、方便、高效等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。因此 術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的 庫篩選技術(shù)，成為克隆全長 列的常用手段。 其基本原理是：3 錨定引物逆轉(zhuǎn)錄 到第一條 ，然后用含部分錨引物序列的引物與基因特異性引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增得到雙鏈 二輪擴(kuò)增則采用內(nèi)部引物和基因特異引物以防止產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。采用同樣的原理，可以進(jìn)行 5通過 得全