基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展紫花苜蓿耐逆轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展 摘要：本文綜述了苜?？购?、抗旱、耐鹽堿、耐酸鋁等耐逆轉(zhuǎn)基因方面的國內(nèi)外研究進(jìn)展，并就苜蓿轉(zhuǎn)基因工程研究的發(fā)展方向做了展望，旨在為紫花苜蓿耐逆育種提供參考。 關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；耐逆；轉(zhuǎn)基因 通過基因工程的方法提高作物的抗性是近年來研究的熱點(diǎn)，自1986年首例農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因苜蓿獲得成功，紫花苜蓿耐逆轉(zhuǎn)基因方面已取得突破性進(jìn)展，對(duì)植株的耐逆性有了較大的提升。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種手段，針對(duì)性地開展耐逆紫花苜蓿研究，有利于豐富我國苜蓿的品種資源，推動(dòng)南方苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本文綜述該方面的研究進(jìn)展，旨在為紫花苜蓿的耐逆育種提供重要參考。 1、抗旱耐寒轉(zhuǎn)基因 在干旱和冷害條件下，植物細(xì)胞中會(huì)積累大量活性氧，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜質(zhì)、DNA及其它細(xì)胞組分嚴(yán)重?fù)p傷，紫花苜蓿植株內(nèi)的各種酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)可有效清除活性氧。超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化脅迫防御體系的重要成分，SOD是目前通過轉(zhuǎn)基因方法提高植物抗寒、抗旱性研究最為積極的對(duì)象。目前已經(jīng)克隆受干旱脅迫誘導(dǎo)的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶基因。將煙草的Mn-SOD酶表達(dá)于苜蓿，使苜?？购敌蕴岣摺Ｔ谵D(zhuǎn)基因紫花苜蓿中，葉綠體SOD的過量表達(dá)，提高了對(duì)氧化脅迫的耐受性；SOD在苜蓿線粒體中的過量表達(dá)也具有相同的效果，轉(zhuǎn)基因苜蓿Chl SOD的過量表達(dá)提高了對(duì)凍害的耐受性。Zhang等將轉(zhuǎn)錄因子(AP2)的cDNA(WXP1)置于35S啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)化苜蓿，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因苜蓿葉片表面的表皮蠟層增厚，減少水分散失，抗旱能力增強(qiáng)。Jiang Q采用CER6啟動(dòng)子在苜蓿中超表達(dá)WXP1基因，轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力提高，并且發(fā)現(xiàn)該基因還與光合作用有關(guān)。 Mckersie等將煙草Mn-SOD的cDNA與CaMV35S啟動(dòng)子構(gòu)建了pMistSOD和pChslSOD的2個(gè)質(zhì)粒載體，分別轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長的抑制明顯減輕，但線粒體和葉綠體定位的Mn-SOD轉(zhuǎn)基因植株間耐逆性差異不顯著。經(jīng)2個(gè)冬季試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的越冬成活率高于未轉(zhuǎn)化植株，產(chǎn)量提高25%，轉(zhuǎn)基因植株葉片和根中的SOD酶活性顯著增加。Mckersie等將擬南芥Fe-SOD基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，試驗(yàn)表明， Fe-SOD基因的超表達(dá)降低了低溫對(duì)植物的次級(jí)傷害，從而提高了其恢復(fù)能力。韓利芳等將煙草Mn-SOD基因的cDNA序列導(dǎo)入保定苜蓿，誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因植株的再生，MnSOD活性檢測(cè)表明，部分轉(zhuǎn)基因植株的Mn-SOD活性顯著提高。Shearer等將修飾過的SPS（蔗糖磷酸合成酶）基因結(jié)合35S啟動(dòng)子導(dǎo)入紫花苜蓿，試驗(yàn)證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性增加。 2、耐鹽堿轉(zhuǎn)基因 在紫花苜蓿耐鹽轉(zhuǎn)基因方面，Wincov和 Winicov先后將Alfinl基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ?，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Alfin1在紫花苜蓿中的過量表達(dá)，不僅提高了紫花苜蓿根中特異內(nèi)源基因MsPRP2的積累水平，而且轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性也顯著提高。蘇金等比較了3個(gè)轉(zhuǎn)Alfin1基因紫花苜蓿植株在鹽脅迫條件下的生長特性，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的生長量是受體對(duì)照植株的23倍，證實(shí)了Alfinl的超量表達(dá)能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的氯化鈉抗性。晏石娟等對(duì)導(dǎo)入果聚糖合成酶基因的紫花苜蓿進(jìn)行耐鹽生長適應(yīng)性的研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化苗比對(duì)照苗耐受鹽脅迫的能力要高，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)化苗的根生長能力要強(qiáng)于對(duì)照苗，表明轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的抗性比對(duì)照耐鹽能力強(qiáng)。 胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白 (1ate embryogenesis abundant, LEA)是目前植物逆境生物學(xué)研究中受高度關(guān)注的抗脅迫功能蛋白質(zhì)，具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性，lea基因的表達(dá)量與植物抗旱耐鹽能力呈正相關(guān)。王瑛等利用基因槍法將大麥的lea3基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｆ贩N“中苜一號(hào)”，獲得轉(zhuǎn)基因植株在高鹽脅迫下具有較高的存活率，耐鹽能力約是原品種的4倍，表明轉(zhuǎn)lea3基因可用于苜?？购的望}育種。肖荷霞等以苜蓿(Medicago sativa)品種中苜一號(hào)為試材，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。通過基因槍法將大麥的胚胎發(fā)生豐富蛋白基因lea3導(dǎo)入愈傷組織細(xì)胞，于8 mgL PPT的選擇壓力下篩選2個(gè)月，獲得抗性愈傷組織及再生植株，將再生植株再次轉(zhuǎn)入含有PPT的誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基中篩選。經(jīng)PCR檢測(cè)，2l株再生植株中有2株擴(kuò)增出了目的基因片段。證明lea3基因已導(dǎo)入了苜蓿細(xì)胞中。 楊金慧等選用公農(nóng)1號(hào)紫花苜蓿，以57d苗齡的無菌子葉為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有甜菜堿醛脫氫酶(BADH)和酸性蛋白酶(pepB)雙價(jià)基因的無選擇標(biāo)記表達(dá)載體導(dǎo)入苜蓿子葉中，并用含有Na2CO3和NaHCO3堿性鹽溶液的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到抗鹽堿轉(zhuǎn)化植株。劉艷芝等用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將克隆于酵母的HAL1基因轉(zhuǎn)化龍牧803苜蓿胚性愈傷組織，培養(yǎng)基耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，HAL1基因已在龍牧803苜蓿中表達(dá)，并提高了耐鹽性。 3、耐酸鋁轉(zhuǎn)基因 紫花苜蓿對(duì)土壤鋁毒極為敏感，鋁離子主要抑制紫花苜蓿根系的生長，從而使其嚴(yán)重減產(chǎn)。近年來研究表明，通過轉(zhuǎn)化一些有機(jī)酸合成的相關(guān)基因可提高紫花苜蓿的耐鋁性。 蘋果酸是一種有效游離鋁離子鰲合劑，由草酸乙酸經(jīng)蘋果酸脫氫酶(Malate Dehydorgenase, MDH)催化形成。Tesfafe等將苜蓿根瘤蘋果酸脫氫酶基因(neMDH)轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸和乙酸的含量均有所增加，對(duì)鋁的耐受性也相應(yīng)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因植株根系中檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸和乙酸含量是對(duì)照的4.2倍；將轉(zhuǎn)基因植株在石英砂中培養(yǎng)時(shí)，其根部分泌的檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸和乙酸是對(duì)照的7.1倍；在20mol/L的AlCl3中，轉(zhuǎn)基因植株根系的長度是對(duì)照的2-3倍，在100mol/L的AlCl3中，對(duì)