.,1,與基因工程學(xué)科建立相關(guān)的1、4個里程碑事件：2、3大技術(shù)發(fā)現(xiàn)/發(fā)明：,第二章重組技術(shù)基礎(chǔ),DNA組成與結(jié)構(gòu),一級結(jié)構(gòu)堿基的排列順序,二級結(jié)構(gòu)DNA的雙螺旋形式,高級結(jié)構(gòu)DNA的超螺旋形式,核酸分子組成,DNA的分子結(jié)構(gòu),（一）核酸的分類,.戊糖,（構(gòu)成RNA）,1,2,3,4,5,-D-呋喃核糖(ribose),（構(gòu)成DNA）,-D-2-脫氧呋喃核糖(deoxyribose),2.堿基,嘌呤(purine),嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),腺嘌呤(adenine,A),鳥嘌呤(guanine,G),核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR,3.核苷(ribonucleoside),堿基核糖（脫氧核糖）連接方式：CN糖苷鍵堿基（9/1位）戊糖（1，位）,1,1,核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,.核苷酸(ribonucleotide),核苷（脫氧核苷）磷酸磷酸酯鍵,.核苷酸的連接,，磷酸二酯鍵,C,G,A,二、核酸的一級結(jié)構(gòu),定義：核酸中核苷酸的排列順序（堿基序列）。,書寫方法,5pApCpTpGpCpT-OH3,5ACTGCT3,豎式,橫式,簡化式,DNA的空間結(jié)構(gòu),一、DNA的二級結(jié)構(gòu)（一）雙螺旋結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（Watson,Crick,1953）,兩條DNA單鏈分子反向平行環(huán)繞，右手螺旋走向，表面大溝與小溝相間。螺旋直徑為2nm，主鏈：戊糖磷酸骨架位于外側(cè)側(cè)鏈：堿基對位于內(nèi)側(cè)堿基平面垂直于螺旋軸堿基距：0.34nm；螺距：3.4nm；周長：10對堿基。,堿基形成氫鍵配對，配對形式為：A=T;GC）。,堿基互補配對,T,A,C,G,穩(wěn)定因素：1.氫鍵維持橫向穩(wěn)定性，2.堿基堆積力維持縱向穩(wěn)定性。3.介質(zhì)中陽離子可以有效地屏蔽磷酸基之間的靜電斥力,（二）與DNA堿基順序相關(guān)的特殊結(jié)構(gòu),堿基順序顛倒重復(fù)而具有2倍對稱的DNA段落,鏡像重復(fù)序列,tsDNA是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的，三條鏈均為同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。,（三）三股螺旋DNA（tsDNA,也稱H-DNA）,Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中穩(wěn)定，較多見,(四)酶活性DNA,1995年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)了具有酶活性的DNA，再次豐富了酶學(xué)。Cuenoud根據(jù)共有序列設(shè)計并合成了由47個核苷酸組成的單鏈DNA-E47，以此連接兩個底物DNAS1和S2,二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝,（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu),超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。,正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同,負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反,意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。,（二）原核生物DNA的高級結(jié)構(gòu),（三）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝,真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是核小體(nucleosome)。,DNA：約200bp組蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4,核小體的化學(xué)組成,RNA的結(jié)構(gòu),StructureofRNA,RNA的種類、分布、功能,mRNArRNAtRNA,一、mRNA的結(jié)構(gòu)與功能,內(nèi)含子(intron),外顯子(exon),*真核細(xì)胞mRNA結(jié)構(gòu)特點,5末端有甲基化鳥苷帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-,2.3末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。,帽子結(jié)構(gòu),促進(jìn)mRNA由胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位維持mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的調(diào)控,帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能,*mRNA的功能把DNA的堿基序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸順序。,*tRNA的一級結(jié)構(gòu)特點含1020%稀有堿基，如DHU3末端為CCA-OH5末端大多數(shù)為G具有TC,二、轉(zhuǎn)運RNA的結(jié)構(gòu)與功能,*tRNA的二級結(jié)構(gòu)三葉草形氨基酸臂DHU環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)TC環(huán),氨基酸臂,額外環(huán),*tRNA的三級結(jié)構(gòu)倒L形,*tRNA的功能活化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。,*rRNA的結(jié)構(gòu),三、rRNA的結(jié)構(gòu)與功能,*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。,rRNA的種類,真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA,原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA,S（沉降系數(shù)）：單位時間內(nèi)的沉降速度,核酸的理化性質(zhì)ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid,1.核酸的溶解度核酸是極性分子，微溶于水，不溶于乙醇或異丙醇。DNA+蛋白質(zhì)脫氧核糖核蛋白（DNP）：在1mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白質(zhì)核糖核蛋白（RNP）：在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。,一、核酸的一般理化性質(zhì),核酸屬于兩性電解質(zhì)，但因為磷酸的酸性較強，因此總體呈現(xiàn)較強的酸性。具有較低的等電點。當(dāng)溶液的pH4時，呈多負(fù)離子狀態(tài)，容易與金屬離子結(jié)合形成鹽。,2.酸堿性,3.核酸的高分子性質(zhì)粘度：DNARNAdsDNAssDNA4.核酸的紫外吸收(OD260)單核苷酸ssDNA(或RNA)dsDNA,5.核酸的化學(xué)性質(zhì)核酸中的嘌呤和嘧啶能進(jìn)行脫氨、聚合、烷基化等反應(yīng)等。脫氨：CU,脫氨：CU,A,T,C,G,A,A,T,T,G,C,A,T,U,G,A,A,T,T,A,C,千萬年后，GC將不復(fù)存在,聚合紫外光誘導(dǎo)兩個相鄰嘧啶之間形成二聚體,二、DNA的變性(denaturation),定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。,方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。,變性后其它理化性質(zhì)變化：,OD260增高粘度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,例：變性引起紫外吸收值的改變,DNA的紫外吸收光譜,增色效應(yīng)：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。,熱變性,解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。,Tm：DNA變性時紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。,影響Tm的因素：1.G+C含量:G+C越高，Tm越高2.DNA樣品均一性：均一的DNA樣品，Tm范圍較狹窄。3.核酸的種類：雙鏈RNARNA-DNA雜交鏈DNA雙鏈4.溶液的離子強度：離子強度高，Tm值高。,三、DNA的復(fù)性與分子雜交,DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。,減色效應(yīng)DNA復(fù)性時，其溶液OD260降低的現(xiàn)象。,熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。,不同來源的核酸鏈分子復(fù)性時形成雜化雙鏈過程叫分子雜交。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。,核酸分子雜交(hybridization),核酸分子雜交的應(yīng)用研究DNA分子中某一種基因的位置確定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯