.,1,肉毒毒素介紹,.,2,主要內(nèi)容,肉毒毒素介紹歷史發(fā)展結(jié)構(gòu)作用機(jī)理藥理毒理免疫原性目前商用的肉毒素的特點(diǎn)肉毒素注意事項(xiàng),.,3,什么是肉毒毒素?(肉毒神經(jīng)毒素,肉毒桿菌神經(jīng)毒素，肉毒梭菌毒素),是肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種細(xì)菌外毒素一種厭氧菌，其孢子常規(guī)在土壤中，與產(chǎn)生破傷風(fēng)毒素的細(xì)菌屬同一科在合適的條件下（10oC，無氧，合適的酸度）孢子生長為梭菌細(xì)菌繼續(xù)產(chǎn)生大量的孢子或自溶將毒素釋放出來不同的菌株(如Hall株,Bean株)產(chǎn)生不同亞型的神經(jīng)毒素(分為A、B、C、D、E、F、G等7個抗原型),其中A型毒力最強(qiáng)是導(dǎo)致肉毒中毒(Botulism)的原因,.,4,生物制品的特定,沒有仿制品的概念肉毒毒素是一類產(chǎn)品名，而非通用名與疫苗接近產(chǎn)品本身沒有專利，生產(chǎn)工藝專利用單位（Unit）衡量，單位之間不能換算很容易得到，很難提純，很難恒定,不可認(rèn)為肉毒毒素是相同的彼此不可換算,FDA最新通告：,.,5,歷史和發(fā)展（1）,1920s,1944,1946,首次沉淀純化A型肉毒毒素（H.Sommer),Schantz開始研究其特性和應(yīng)用,Lammanna首次分離出A型肉毒素結(jié)晶,1820,1895,JustinusKerner推測“臘腸毒”作用原理，并提出應(yīng)用于治療的可能性,EVanErmengem分離肉毒梭狀芽胞桿菌,.,6,歷史和發(fā)展（2）,1960s1970s,1978,1984,Schantz和Scott繼續(xù)研究,Scott在猴子身上進(jìn)行A型肉毒毒素治療斜視的試驗(yàn),Scott獲得FDA批準(zhǔn)在人身上進(jìn)行試驗(yàn)（眼瞼痙攣，半面肌痙攣）,1950s,1950s1960s,VBrook證實(shí)A型肉毒毒素阻斷乙酰膽堿釋放,純化過程優(yōu)化(DuffandSchantz),MFBrint用于治療眼瞼痙攣，半面肌痙攣斜頸，喉部肌張力障礙，書寫痙攣等,.,7,歷史和發(fā)展（3）,1998,2006,2009,FDA批準(zhǔn)低蛋白劑型每100單位5ng,1989,1997,Allergan獲得FDA批準(zhǔn)以BOTOX商品名上市；用于治療眼瞼痙攣，斜視和第VII神經(jīng)功能紊亂,Allergan公司獲得對A型肉毒素的所用權(quán),1998年6月中國藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)保妥適用于治療眼瞼痙攣、面肌痙攣及相關(guān)病灶肌張力障礙。,2006年6月GSK在中國上市保妥適,2002,FDA批準(zhǔn)美容適應(yīng)癥,83個國家22個適應(yīng)癥,2月11日獲中國SFDA批準(zhǔn)用于皺眉紋,.,8,不是個合適的生化武器,溫度、濕度，空氣和光照都會使毒素降解霧狀的毒素，很不穩(wěn)定常規(guī)的消毒方法既能使其滅活氯，加熱85C5分鐘人與人不能傳播存在肉毒素抗毒素（但對已經(jīng)存在的癥狀無效）,.,9,高純度的保妥適治療不會導(dǎo)致肉毒中毒,肉毒中毒:肉毒毒素導(dǎo)致的一種全身性的反應(yīng)保妥適是高度純化的肉毒素局部注射治療,直接注射在相關(guān)肌肉或腺體上如劑量合適,很少彌散到其它肌肉治療劑量與中毒劑量相差很遠(yuǎn)皺眉紋標(biāo)準(zhǔn)劑量：20U,致死劑量(70kg人)靜脈注射3,000單位,要導(dǎo)致死亡,需靜脈注射30瓶以上保妥適,每瓶保妥適只含100單位純化的肉毒素,每瓶保妥適含蛋白5ng1ng=10-9g,.,10,保妥適是局部用藥,Aoki,Neurology2003;60(5Suppl1):A212-A213ABS-P03.088,本研究的臨床相關(guān)性有待明確,靶肌肉,鄰近肌肉,全身作用,在治療劑量內(nèi)，血液中檢測不到肉毒素,.,11,前體毒素900KD復(fù)合體HA(Haemagglutinin),血凝素NTNHnon-toxicnon-haemagglutinins非血凝素蛋白,肉毒素結(jié)構(gòu),150KD,100KD,50KD,與靶位受體結(jié)合，促輕鏈內(nèi)轉(zhuǎn),以鋅肽鏈內(nèi)切酶實(shí)施毒效,血凝素維持毒素三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定影響結(jié)構(gòu)因素：熱變性，堿性條件空氣/液體介面形成的氣泡改變毒素形態(tài)，氮?dú)?二氧化碳稀釋至過低濃度,.,12,作用機(jī)理(1),.,13,作用機(jī)理(2),尚有其它作用機(jī)理如疼痛,.,14,作用機(jī)理錄像,.,15,作用過程,主要步驟：結(jié)合（Binding）：A型肉毒素的重鏈與運(yùn)動神經(jīng)終板上的乙酰膽堿受體高親和結(jié)合攝入（Internalization)：毒素通過受體介導(dǎo)的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這一過程中神經(jīng)末端細(xì)胞膜將毒素包裹，在神經(jīng)末梢內(nèi)形成毒素囊泡。攝入后，肉毒素的輕鏈從囊泡中被釋放到胞漿內(nèi)，現(xiàn)在已非常明確輕鏈具有阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)。阻斷（Blocking)A型肉毒素通過裂解膽堿能神經(jīng)末梢突觸前膜內(nèi)SNAP-25而阻滯乙酰膽堿的釋放。SNAP-25是一種在細(xì)胞膜上促使神經(jīng)末梢內(nèi)囊泡與突觸前膜順利融合并釋放乙酰膽堿的必需蛋白質(zhì)。這過程阻止肌肉收縮，但并不影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和儲存，也不影響電信號沿神經(jīng)纖維傳導(dǎo)。神經(jīng)芽生(Sprouting)充分證據(jù)表明肉毒素介導(dǎo)的神經(jīng)肌肉接頭的化學(xué)去神經(jīng)化作用并沒有影響終板區(qū)域，也沒有影響軸突的生長，芽神經(jīng)與終板結(jié)合連接釋放神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)再生“芽生”是暫時的，會逐漸消退，原始的神經(jīng)肌肉接頭恢復(fù)功能。,.,16,乙酰膽堿的作用,顱神經(jīng),骶神經(jīng),胸腰神經(jīng),節(jié)前神經(jīng)節(jié)節(jié)后,CNS,副交感神經(jīng),交感神經(jīng),交感神經(jīng),交感神經(jīng),軀體運(yùn)動神經(jīng),Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,Ach,N,M,交感神經(jīng),NE,N,N,N,N,Ach,M,D,N,Epi,Ach,膽堿能性神經(jīng)：運(yùn)動神經(jīng)全部植物神經(jīng)節(jié)前纖維大多數(shù)副交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配小汗腺和血管肌肉的交感神經(jīng)節(jié)后纖維,.,17,疼痛作用的發(fā)現(xiàn)-Rejia試驗(yàn),基本設(shè)計(jì)：36個病人有疼痛性斜頸隨機(jī)，雙盲分成4組25U,50U,100U,及150U一個治療周期，每周觀察直至12周觀察指標(biāo)：主要終點(diǎn)：TWSTRS(TotontoWesternSpasmodicTorticollisRatingScale)疼痛頻率疼痛強(qiáng)度次要終點(diǎn)醫(yī)生及病人全球評定量表（GlobalAssessmentScale),.,18,Reljia試驗(yàn)結(jié)果,組1：25U,組2：50U,組3：100U,組4：150U,疼痛和斜頸均無變化,斜頸無改變，但疼痛改善,疼痛改善1周后改善斜頸2周后改善,結(jié)論：保妥適可能有直接止痛效果，獨(dú)立于其肌肉放松的效果,.,19,SNAP-25,Ca+Channels,Syntaxin,VAMP/synaptobrevin,還阻滯其它物質(zhì)的釋放,對疼痛的作用,Glutameat,cGRP,SubstanceP,.,20,軀體運(yùn)動神經(jīng)元-梭外肌-收縮減少梭內(nèi)肌-傳入信號減弱,內(nèi)臟運(yùn)動神經(jīng)元-內(nèi)臟平滑肌收縮減少腺體分泌減少,痛覺感受器,肉毒毒素阻滯位點(diǎn),作用機(jī)理的臨床意義,.,21,BOTOX臨床應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,失馳緩癥,多汗癥*,偏頭痛,痙攣性斜頸*,腦癱,眼瞼痙攣*,神經(jīng)肌肉,自主神經(jīng),感覺神經(jīng),膀胱,美容*,.,22,保妥適全球被批準(zhǔn)情況,83個國家，22個適應(yīng)癥,.,23,保妥適在中國的適應(yīng)癥,1998：眼瞼痙攣、面肌痙攣及相關(guān)局灶性肌張力障礙。,2009年2月：暫時改善65歲及65歲以下成人因皺眉肌/或降眉間肌活動引起的中度至重度皺眉紋。,.,24,PerformtheIodineStarchTest,Useasurgicalpenandstandardrulertomarkinjectionpoints:1to2cmapartStaggeredtoallowforringeffectofintradermalinjections,CountinjectionpointsandallocaterecommendeddosageofBOTOXsolutionperinjection,basedon:50Unitsperaxilla,PleaseseeImportantSafetyInformationonslide12.,.,25,BOTOXInjection,Injectata45angletoskinsurfaceBevelsideuptominimizeleakageandensureinjectionsremainintradermalAdepthofapproximately2mm,Besurenottoinjectdirectlyoninkmarktoavoidapermanenttattooeffect,PleaseseeImportantSafetyInformationonslide12.,.,26,基本藥理,單位的定義有效性安全性抗原性,.,27,單位的定義,生物制品用單位(Unit),而不用mg衡量肉毒素單位定義:1Unit(單位)=i.p.LD50小鼠腹膜內(nèi)注射配制后的本品溶液的半數(shù)致死量(LD50)不同廠家的肉毒素單位（Unit）彼此不能互換有各自的實(shí)驗(yàn)和檢測方法,說明書：本品的推薦劑量不可與其他肉毒梭菌毒素制劑的劑量互換。,文獻(xiàn)上關(guān)于保妥適的推薦劑量只適用于保妥適，對其他A型肉毒毒素不一定適用。,.,28,有效性的判斷,局部有效性：用DAS評估DigitAbductionScore小鼠后趾外展評分方法測試去神經(jīng)化程度局部肌肉注射的ED50半數(shù)有效量DAS=2時劑量,DAS評分方法,注射前,注射后,4分嚴(yán)重弱化,0分沒變化,1分,2分,3分,.,29,用DAS測試小鼠肌肉弱化程度,.,30,DAS量效關(guān)系（對數(shù)值）,平均DAS峰值,毒素劑量,U/kg,此圖可用來比較不同產(chǎn)品的效力,.,31,J.FrancisPoster#51,Toxins2005,平均DAS(小鼠后趾外展肌評分方法測試去神經(jīng)化程度)峰值效應(yīng)曲線,保妥適效力最高的肉毒素,*p0.05one-wayANOVAandposthocTukeyt-test,*注意：非線性關(guān)系,.,32,局部和全身效應(yīng)：彌散系數(shù),全身效應(yīng),彌散,平均DAS峰值,毒素劑量,U/kg,達(dá)到最大局部效果,彌散系數(shù)(DiffusionMargin),=,Atrthresh,ED50,Atrthresh:注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量,作為局部注射藥，肉毒素一般沒有口服藥所具有的全身作用在臨床使用中，很多副反應(yīng)是由于藥物不適當(dāng)彌散造成的臨近肌肉全身,K.RogerAoki,PhD,PharmacologyofBotulinumToxins,.,33,不同產(chǎn)品的彌散性不一樣,在達(dá)到最大局部效應(yīng)前就從注射部位彌散出去了,Aoki,Neurology2003;60(5Suppl1):A212-A213ABS-P03.088,本研究的臨床相關(guān)性有待明確,.,34,抗原性,抗原:能觸發(fā)抗體產(chǎn)生的外來分子，抗原表面有非常特異性的抗體結(jié)合部位，這稱為抗原決定簇?？贵w:抗體（也稱為免疫球蛋白Ig）是針對抗原而產(chǎn)生的。只有相對應(yīng)的抗原決定簇出現(xiàn)時，抗體才被激活。免疫應(yīng)答反應(yīng)具有記憶和強(qiáng)化功能,.,35,中和抗體使毒素失去作用,中和抗體,中和抗體,非中和抗體,非中和抗體,.,36,抗原測試方法（I）,WBA（WesternBlotAnalysis蛋白印跡分析）不能區(qū)分中和抗體和非中和抗體ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))分析血標(biāo)本中有無保妥適抗體及其含量的敏感的體外方法。ELISA不能區(qū)分保妥適的中和抗體與非中和抗體,.,37,抗原測試方法（II）,MPA(Mouse-ProtectionAssay小鼠保護(hù)試驗(yàn))是目前測試抗體的金標(biāo)準(zhǔn)唯一能準(zhǔn)確測試中和抗體的方法價格昂貴、費(fèi)時,只有陰性和陽性之分FTAT(FrontalisAntibodyTest前額抗體試驗(yàn))簡便,很快有結(jié)果與其它方法相關(guān)性好,=7.5U,=15U,.,38,效果不佳不都是因?yàn)榭贵w,注射技術(shù)不正確如劑量過低或注射在錯誤的肌肉上對所注射的肌肉功能了解不全沒有注射所有引起癥狀的肌肉要達(dá)到功能效果還需控制拮抗肌肌肉攣縮已到固定程度,.,39,減少抗體產(chǎn)生的危險,每次使用最低劑量也就是降低接觸神經(jīng)毒素蛋白(ng)的可能延長使用間隙由產(chǎn)品的作用時間決定使用高純度，性質(zhì)穩(wěn)定/均一的產(chǎn)品新配方大大降低抗體的產(chǎn)生率*,Jankovicetal.(2003)Yablonetal.(2005):,.,40,保妥適的特點(diǎn),.,41,目前商用肉毒素,.,42,全球第二大醫(yī)藥公司，占世界醫(yī)藥市場的62007年銷售額$45.8billion114個國家超過100,000名員工中國投資超過4億美元，5家企業(yè)國內(nèi)主要處方產(chǎn)品：肝炎，代謝類，呼吸，神經(jīng),中等規(guī)模的專業(yè)生物醫(yī)藥公司年銷售額$3billion,6,000員工主要產(chǎn)品：醫(yī)學(xué)美容：保妥適，填充劑，面霜眼科產(chǎn)品,GSK這樣的大公司一定挑選這個領(lǐng)域中的最優(yōu)秀產(chǎn)品,.,43,純度高,質(zhì)量恒定,肉毒毒素是一種生物產(chǎn)品，其生產(chǎn)工藝遠(yuǎn)比化學(xué)藥品復(fù)雜。很難做到批與批，瓶與瓶之間的質(zhì)量恒定。生產(chǎn)過程中不慎被滅活的肉毒毒素?zé)o治療作用，但具有免疫原性，可激發(fā)肌體產(chǎn)生抗體，令使用者產(chǎn)生繼發(fā)性無應(yīng)答。,使用保妥適，醫(yī)生可精確知道所注射的劑量，無需擔(dān)心其他雜質(zhì)注入使用者體內(nèi)。,.,44,J.FrancisPoster#51,Toxins2005,平均DAS(小鼠后趾外展肌評分方法測試去神經(jīng)化程度)峰值效應(yīng)曲線。,保妥適效力最高的肉毒素,*p0.05one-wayANOVAandposthocTukeyt-test,*注意：非線性關(guān)系,肉毒素彼此不等價！100U100U,.,45,得到均一900KD大分子量,900kDa,500kDa,Schantz純化工藝法,均一的900KD分子量,不容易彌散到周圍肌肉,.,46,保妥適:900,000Dalton,水18Dalton（50,000倍）,青霉素388.48Dalton(2,317倍）,分子量比較,.,47,彌散系數(shù)比較,Atrthresh:注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量在達(dá)到相同的療效時,保妥適比其它肉毒素更不容易彌散到遠(yuǎn)端肌肉,J.FrancisPoster#51,Toxins2005PresentedatToxins2005,Denver,CO,June22-25,2005.,.,48,良好的彌散系數(shù),全身效應(yīng),彌散系數(shù)(DiffusionMargin),=,Atrthresh,ED50,Atrthresh:注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量,作為局部注射藥，肉毒素一般沒有口服藥所具有的全身作用在臨床使用中，很多副反應(yīng)是由于藥物不適當(dāng)彌散造成的臨近肌肉全身,在達(dá)到最大局部效應(yīng)前就從注射部位彌散出去了,Atrthresh:注射腓腸肌后引起同側(cè)四頭肌萎縮的最低劑量,臨床相關(guān)性需進(jìn)一步確認(rèn),.,49,保妥適能更好地集中在靶肌肉上,.,50,保妥適使用真空干燥法,真空干燥法VacuumDried,液體固體,冰凍干燥法Lyophilized,固體固體,保妥適,其它A型肉毒素,凍干易形成類毒素?zé)o活性，但有免疫原性需要明膠作為穩(wěn)定劑來降低凍干損失量,.,51,明膠是強(qiáng)致敏劑,明膠可對凍干中的蛋白質(zhì)起保護(hù)作用可能會引起瘋牛病是強(qiáng)過敏源，國際上已不推薦為敷料,國內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)也顯示，CBTX-A組5例出現(xiàn)皮疹；BOTOX組無一例發(fā)生。,Blairetal.JClinNeurosci2004;22(Suppl1):S103-4ABS-POS3RNOTporcine湯曉芙萬新華A型肉毒毒素治療局限性肌張力障礙和肌肉痙攣中華神經(jīng)科雜志1999年6月第32卷第3期,含有明膠的肉毒素是強(qiáng)致敏劑反復(fù)暴露會增加皮膚過敏率,圖示為動物實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果,.,52,保妥適始終是市場的領(lǐng)導(dǎo)者,Source:AGNGlobalMktResearch,2007WWBoNTMarketSales$1.4B,.,53,我們更關(guān)心產(chǎn)品銷售出去后的問題,持續(xù)性地在全球收集安全性數(shù)據(jù),.,54,不良反應(yīng)維持在較低水平,.,55,大量的文獻(xiàn)支持保妥適有效性和安全性,近4,000份資料寬度：100多個用法時間：MejiaNetal平均15.8年,MejiaNetal.Long-termbotulinumtoxinefficacy,safetyandimmunogenicity.MovDisord2005;20(5):592597.,.,56,我們力求提供給醫(yī)生最有價值的服務(wù),.,57,我們力求提供給醫(yī)生最有價值的服務(wù),注射軟件,注射記錄表,.,58,外科記號筆,.,59,保妥適配制方法,.,60,包裝和防偽,包裝規(guī)格：1支/盒容器：帶橡膠塞并用鋁箔密封的10ml容量的I型無色玻璃瓶。小瓶的標(biāo)簽上印有“Allergan”字樣的全息膠皮,上有平行的彩虹條文為了能看到全息圖片,需要在臺燈或熒光燈下前后旋轉(zhuǎn)小瓶在生長日期/批號地方?jīng)]有全息圖片,.,61,配制步驟:1,最好在塑料布上進(jìn)行配制，以防止液體的外濺。選用21Gauge（0.813mm）,約1.5英寸（3.8cm）長的針頭抽取適量(參見稀釋表)的不含防腐劑的生理鹽水(0.9%氯化鈉液),.,62,以45的角度將針插入保妥適瓶內(nèi)，瓶內(nèi)真空會將生理鹽水自動吸入,為避免產(chǎn)生過多泡沫,請稍用力持住筒芯,使生理鹽水緩慢進(jìn)入。這一過程能檢驗(yàn)瓶內(nèi)是否真空，若為非真空則棄用。,配制步驟:2,.,63,將注射筒從針頭上拔下，讓空氣通過針頭進(jìn)入瓶內(nèi)，中和負(fù)壓。輕輕地旋轉(zhuǎn)小瓶，使保妥適在生理鹽水中溶解，不要翻轉(zhuǎn)震動瓶子。,配制步驟:3,.,64,用另一新的無菌注射筒接上針頭，從瓶底一角抽出稀釋液，勿將小瓶翻轉(zhuǎn)。,配制步驟:4,.,65,將用于配制的21Gauge(0.813mm）針頭拔下，換上與所注射適應(yīng)癥相應(yīng)的針頭：眼瞼痙攣、面肌痙攣使用30Gauge（0.305mm）針頭；如需肌電圖引導(dǎo)定位，使用涂有特氟隆的針頭.,配制步驟:5,.,66,稀釋表,配制好的溶液應(yīng)是無色至淡黃色的液體，不含任何顆粒使用配制溶液之前應(yīng)肉眼檢查澄明度及有無雜質(zhì)，本品只能單次使用，剩余溶液應(yīng)丟棄。,.,67,附件針頭度量,ISO9626:Stainlesssteelneedletubingforthemanufactur