實(shí)驗(yàn)三 殺蟲(chóng)劑對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用一、試驗(yàn)原理和目的在昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性突觸中，乙酷膽堿是主要神經(jīng)遞質(zhì)，它通過(guò)生物合成、釋放以及與受體的結(jié)合，使得神經(jīng)傳導(dǎo)能正常進(jìn)行。當(dāng)神經(jīng)接受到某一刺激時(shí)，沖動(dòng)傳導(dǎo)到突觸處，就由突觸前膜釋出含有乙膽堿的小囊胞，一次沖動(dòng)可釋出小囊胞100-150個(gè)，每個(gè)小囊胞含有乙酰膽堿(ACh)分300-2000個(gè)。在突觸后膜上約有乙酰膽堿分子900個(gè)就可產(chǎn)生局部膜電位的去極化，致神經(jīng)傳導(dǎo)正常進(jìn)行。多余的乙酰膽堿分子及完成刺激受體后而解離的乙酰膽堿分子應(yīng)立即被突觸間隙的乙酰膽堿酯酶(AChE)所水解，使神經(jīng)又處于靜止?fàn)顟B(tài)而有利于迎接下一個(gè)刺激。因此，比較乙酰膽堿酯酶的活力和性質(zhì)，可以作為測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)。有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑在昆蟲(chóng)體內(nèi)主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)，抑制膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)的阻抑而引起昆蟲(chóng)中毒死亡。研究其毒理機(jī)制，膽堿酯酶活力是重要指標(biāo)之一。其活力測(cè)定方法較多，發(fā)展較快，有測(cè)壓和測(cè)pH法、比色法、電化學(xué)法、熒光法、放射法等。其中比色法中由于應(yīng)用的底物和顯色劑不同，又有不同的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)主要介紹一種常用的比色測(cè)定方法乙酰硫代膽堿一二硫雙對(duì)硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。該法是Ellmanl961年創(chuàng)制的方法，其原理是應(yīng)用乙酰硫代膽堿(ASCh)為底物，在膽堿酯酶作用下水解為硫代膽堿及乙酸，然后以二硫雙對(duì)硝基苯甲酸(DTNB)為顯色劑，形成黃色產(chǎn)物，在412nm處有最大吸收峰。生成物濃度和光密度在一定范圍內(nèi)密切相關(guān)，故用分光光度計(jì)可以進(jìn)行定量測(cè)定，以此代表AChE的活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)乙酰膽堿酯酶活力的影響，以理解該兩類(lèi)殺蟲(chóng)劑的作用機(jī)理，并熟練掌握該酶活性測(cè)定方法。二、儀器、試劑和材料1. 儀器721型分光光度計(jì)、冰箱、離心機(jī)、恒溫水浴、勻漿器、具篩刻度試管、吸管等。2. 供試?yán)ハx(chóng)5或6齡的粘蟲(chóng)或家蠅成蟲(chóng)。3. 試劑(1) 1.5%溶液生理鹽水：稱(chēng)取kcl 1.5g，加入98.5ml蒸餾水，置于100ml的容量瓶中。(2) 2.010-3M谷胱甘肽（還原型）生理鹽水溶液：稱(chēng)取谷胱甘肽（還原型）0.030733g，以1.5%的1.5%溶液生理鹽水定容于50ml的容量中。(3) 0.2M PH7.6磷酸緩沖液：取0.2M Na2HPO4溶液435ml和0.2M NaH2PO4 65ml混勻后裝在500ml的容量瓶中。即稱(chēng)取15.579g Na2HPO412H2O和1.01407g NaH2PO42H2O，加入蒸餾水定容至500ml。(4) DTNB-磷酸鹽-乙醇液：稱(chēng)取12.4mgDTNB溶于95%乙醇（120ml）中，加入80ml蒸餾水，再用緩沖液定容至250ml。(5) 0.810-3硫代乙酰膽堿（Asch）生理鹽水溶液：取Asch0.011567g，用1.5%溶液生理鹽水定容至50ml。(6) 配制適當(dāng)濃度的辛硫磷和滅多威丙酮溶液。(7) 考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白含量用試劑。A 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1 000gmL的原液。B 蛋白試劑考馬斯亮藍(lán)G-250的配制：稱(chēng)取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1 000mL。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。C 乙醇D 磷酸（85）（8）供試農(nóng)藥：滅多威原藥（1.0mg/mL）、辛硫磷原藥（1.0 mg/mL）三、操作步驟1. 試蟲(chóng)處理方法用待測(cè)之殺蟲(chóng)劑丙酮溶液以飼喂法或點(diǎn)滴法處理試蟲(chóng)，待表現(xiàn)出明顯中毒癥狀時(shí)，置于冰箱冷凍貯存待用。正常組只用等量丙酮處理蟲(chóng)體，于處理組表現(xiàn)癥狀的同時(shí)，也移于冰箱冷凍室貯存待用。2. 酶液制備方法取處理和正常試蟲(chóng)各10頭，剪取試蟲(chóng)頭殼（帶少量胸部），加入0.2M PH7.6的磷酸緩沖液于冰浴中勻漿（先放入頭殼，加入1.0mlPbs，勻漿，至無(wú)碎片且為渾濁溶液為止，倒入離心管中，分三次共加3.0mlPbs），定容勻漿液至4ml，在冰箱中于4000rpm離心15min，取上清液冷貯供試。3. 酶活性測(cè)定方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支試管，分別加入0.0、0.05、0.1、0.15、0.2和0.25ml10-3M還原型谷胱甘肽溶液，用0.2MpH磷酸緩沖液補(bǔ)足到0.4ml，加入二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）-磷酸-乙醇液3.6ml,在412nm處測(cè)定OD值。以谷胱甘肽濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)做圖，的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。（2）酶活性測(cè)定取處理、對(duì)照酶源各0.2ml，加入0.2mlPH7.6的Pbs（磷酸緩沖液）；再加入0.8mmAsch0.06ml；30溫浴20min；加入DTNB-磷酸鹽-乙醇液，顯色并終止反應(yīng)；于412nm下比色,測(cè)光密度（OD）。4. 蛋白含量測(cè)定方法參照實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)含量測(cè)定（考馬斯G250法）測(cè)定酶液中蛋白含量。四、結(jié)果處理 將測(cè)定的各酶液的OD412帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出被水解的底物含量（mol）。然后將測(cè)定的各酶液的OD595帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出蛋白含量（mg）。以底物含量除以蛋白含量即為各酶液的活力，單位為mol底物/ mg蛋白20min。按照下式計(jì)算各處理酶活力抑制率。酶抑制率(%)= （對(duì)照酶活力處理酶活力）/對(duì)照酶活力100 計(jì)算出酶抑制率后，分析各供試藥劑對(duì)乙酰膽堿酯酶的影響，結(jié)合供試藥劑的作用機(jī)理理論，分析藥劑作用癥狀、酶活力及作用機(jī)理之間的關(guān)系。蛋白含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為01 000gmL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。1. 01 000gmL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支10mL具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄各管測(cè)定的光密度OD595nm，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管 號(hào)1234561 000gmL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.000.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）555555蛋白質(zhì)含量（g）02004006008001 000OD595nm2. 0100